易建华， 潘毛头， 朱振宝

(陕西科技大学生命科学与工程学院， 陕西 西安 710021)

0 引 言

油菜是我国主要的油料作物，年均种植面积1.1～1.2亿亩，产量居世界首位[1].油菜籽榨油后菜籽饼粕中蛋白质含量约为35%～40%.中国每年有约600 万吨菜籽饼粕，是仅次于豆粕的潜在大宗植物蛋白质资源[2].菜籽蛋白是一种营养价值较高的蛋白，其氨基酸组成与大豆蛋白质以及联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)推荐值非常接近[3]，同时菜籽蛋白与大豆蛋白相比具有原料价格优势，因此加强菜籽蛋白的应用研究，使之部分取代大豆蛋白具有重要的经济意义.

由于菜籽饼粕存在硫苷、植酸及多酚类等抗营养因子，极大地限制了其在食品中的应用，目前仅作为肥料使用或少量用于饲料，造成蛋白资源的极大浪费.随着“双低”( 低芥酸，低硫苷)油菜优良品种的培育及大量推广种植，为低毒性或无毒性菜籽蛋白的制备及应用奠定了坚实的基础[4].但迄今为止，“双低”菜籽饼粕蛋白的相关研究多集中于以实验室制备的低温菜籽饼粕为原料[3-5]，而实际上，在工业化过程中工厂多数仍采用传统高温压榨工艺制取菜籽油，但菜籽经高温制油工艺后因变性使蛋白质功能性质大大降低，影响了其在食品加工中的应用[6].因此，通过改性提高高温菜籽蛋白功能性质具有十分重要的意义.

蛋白质改性包括3种方法: 物理法、化学法和酶法[7].目前，由于技术和设备问题，蛋白质物理改性尚未工业化生产.化学改性由于可能造成食品安全性问题，不容易被消费者所接受，而酶法改性是利用蛋白酶在温和的条件下催化水解蛋白质达到蛋白质改性的目的，是一种不降低食品营养价值, 同时又能获得更好食品蛋白质功能特性的简便方法.因此，本文以秦优11号高温“双低”菜籽饼粕为试材，采用NaCl提取结合超滤工艺制备菜籽盐提蛋白(RPSS)，以大豆分离蛋白(SPI)作为对照，研究了RPSS的酶法改性，为高温菜籽饼粕中蛋白质的食用性开发提供技术指导，同时也可以为食品工业提供新的功能性配料.

1 实验

1.1 原料与试剂

原料： “双低”油菜籽(秦优11号)，其高温压榨饼粕成分如表1所示.

蛋白酶：Acalase2.4L®、Flavourzyme®：诺维信(中国)有限公司；其余试剂均为分析纯：西安化学试剂厂.

表1 秦优11号菜籽高温压榨饼粕主要成分

1.2 主要仪器、设备

PB-8型酸度计(赛多利斯公司)；JA5003型电子分析天平(赛利斯科学仪器有限公司)；超级恒温水浴(上海实验仪器厂)； LG10-2.4A离心机(北京医用离心机厂)； RE-52系列旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；SH2-D型循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限公司)；722型光栅分光光度计(上海第三分析仪器厂)；微量凯氏定氮仪，上海洪纪仪器厂；Millipore超滤仪(美国Millipore 公司).

1.3 实验方法

1.3.1 原料预处理

菜籽粕去皮和仁皮分离，粉碎处理后，用石油醚进行脱脂处理，并除去溶剂，干燥后过40目筛，得实验样品， 4 ℃保存备用.

1.3.2 成分测定

粗蛋白：GB 5009.5-2010；粗脂肪：GB 2906-82；植酸：GB5009.153-2003；硫苷：GB/T 23890-2009；灰分：参照GB/T5009.4-2010；水分：参照GB5497-85.

1.3.3 盐提菜籽蛋白(RPSS)制备

称取50 g脱脂菜籽饼粕，加5% NaCl溶液1 000 mL，50 ℃，提取90 min，4 000 r/min离心10 min，上清液采用MWCO50000超滤膜处理，截留液冷冻干燥，备用.

1.3.4 RPSS功能特性研究

1.3.4.1 溶解性

以大豆分离蛋白(SPI)作为对照，准确称取RPSS样品 2.0 g，加入40 mL蒸馏水，以 0.1 mol HCl或0.1 mol NaOH调pH值，40 ℃下搅拌45 min，用中速滤纸过滤，并用少量的蒸馏水冲洗滤渣，定容至50 mL，用微量凯氏定氮法测定上清液中样品及未处理样品中的含氮量.按下式计算氮溶解指数(NSI)：

NSI(%)=(上清液中含氮量/样品总氮)×100%

1.3.4.2 持水性

参照文献[8]方法，称取0.5 g样品，加入10 mL去离子水，在10 min内搅拌6次，然后在3 000 r/min下离心10 min，离心后得到的沉淀物在50 ℃下保持25 min，称量其质量，持水性计算公式：

持水性(%)=(沉淀物质量-样品质量)/样品质量×100%

1.3.4.3 吸油性

参照文献[8]方法，准确称取0.5 g样品于离心管中，加入6 mL大豆色拉油，放置30 min，然后3 000 r/min离心15 min，称量上层大豆色拉油的质量，吸油性计算公式为：

吸油性(%)=(大豆色拉油质量-上层大豆色拉油质量)/样品质量×100%

1.3.5 蛋白酶水解RPSS及对其功能特性的影响

配制1 L 5% RPSS溶液，置于超级恒温反应器，并调至其最适温度及pH，分别加入碱性蛋白酶Aclase2.4L®及Flavourzyme®( E/S=1.5%)，通过滴加0.5 mol/L NaOH保持体系pH恒定.pH-stat法测定水解度(DH)，研究RPSS的酶解进程.酶解液达到相应水解度后，取出酶解液，沸水浴10 min，终止酶解过程，冷却至室温后调pH至7.0，冷冻干燥即得不同DH酶解产物，同时研究酶解对RPSS功能特性的影响.DH计算公式如下[9]：

式中：B—水解过程中消耗NaOH的体积，mL；N—NaOH的浓度，mol/L；α—在实验条件下的氨基解离度，α= 10pH-pK/(1+10pH-pK) (pK=7.0)；MP—蛋白质的质量，g；htot—每克原料蛋白质中肽键的毫摩尔数，mmol/g蛋白质，对于菜籽蛋白，该值取8.38.

2 结果与讨论

2.1 不同蛋白酶水解菜籽蛋白特性的研究

图1 两种蛋白酶水解菜籽蛋白水解进程曲线

由图1可知，两种蛋白酶水解特性有明显差异.碱性蛋白酶Aclase2.4L®的水解能力较强，且在50 min以内水解度上升较快，可达到8.8%；60～350 min，水解速度趋于缓和，水解度变化幅度只有4.2%.而风味蛋白酶Flavourzyme®的水解速度一直比较平缓，水解度变化幅度很小，水解350 min，水解度仅为3.4%.结果说明，不同的蛋白酶对菜籽蛋白的水解度存在显著区别，其原因可能在于酶对底物的作用不同.

2.2 酶法水解对菜籽蛋白溶解性的影响

以SPI为对照，研究了不同水解度(DH 2.0%、5.0%、8.0%、11.0%)Aclase2.4L®菜籽蛋白酶解物与不同水解度(DH 0.6%、1.8%、3.0%)Flavourzyme®菜籽蛋白酶解物的溶解性，结果如图2、3所示.

图2 DH对菜籽蛋白Aclase2.4L®酶解物溶解性影响 图3 DH对菜籽蛋白Flavourzyme®酶解物溶解性影响

由图2、3可知，蛋白酶种类及水解度对RPSS的溶解性影响较大.SPI与RPSS的pI都接近pH4.0，且与SPI相比，相同pH(等电点除外)未酶解处理的RPSS溶解性低于SPI，但随着水解度的增大，RPSS溶解性有不同程度的提高，其原因可能与分子尺寸减小和可电离基团增多以及羰基的暴露有关.由图2可以发现，碱性蛋白酶Aclase2.4L®水解菜籽蛋白， RPSS(DH=11.0%)氮溶指数超过SPI，且在较宽的pH值范围内水解产物具有很好的溶解性，等电点对RPSS溶解性影响不明显.由此可见，深度酶解(DH>10%)更利于改善RPSS溶解性.此外比较图2、3可看出，与Aclase2.4L®相比，风味蛋白酶Flavourzyme®对RPSS溶解性改善作用有限，且当DH为0.6%～3.0%，RPSS的溶解性低于SPI(pI4.0除外)，因此在实际应用过程中，可以采用Aclase2.4L®水解菜籽蛋白来提高RPSS溶解性.

表2 RPSS与SPI持水性和吸油性比较

2.3 酶解对RPSS持水性和吸油性的影响

2.3.1 RPSS与SPI持水性和吸油性比较

由表2可知，RPSS持水性极显著低于SPI(P<0.01)，但其吸油性却极显著高于SPI(P<0.01).蛋白质的持水性与吸油性与其分子表面的极性基团和非极性基团有关，蛋白质分子表面的极性基团越多，则吸水性越强；相反，分子表面的非极性基团越多，则吸油性越强.从表2对比可以推断，RPSS分子表面具有较多的非极性基团，因此其持水性较差，而吸油性较强.

RPSS具有良好的持油性，可应用于高脂食品中，并可促进脂肪与蛋白质结合，从而减少食品蒸煮时脂肪损失；RPSS应用于肉制品中，在保持成品质量的前提下，可降低瘦肉比率，提高产品质地、得率和蛋白质指标，降低成本.

2.3.2 酶解对RPSS持水性影响

蛋白酶Aclase2.4L®和Flavourzyme®，不同DH对RPSS持水性影响结果如图4、5所示.

图4 碱性蛋白酶Aclase2.4L®对RPSS持水性的影响 图5 Flavourzyme®对RPSS持水性的影响

由图4、5可知，经蛋白酶水解后，RPSS持水性表现出降低趋势，且水解度越大，蛋白质的持水性越小；由q检验可知，Aclase2.4L®水解RPSS，除DH5.0 RPSS与DH 8.0 RPSS持水性无显著性差异外，其余都表现出极显著差异(P<0.01)；而Flavourzyme®作用RPSS，水解度为0.6%和 1.8%时，RPSS持水性差异不显著，其余RPSS持水性差异达到极显著.

2.3.3 酶解对RPSS吸油性的影响

图6、7分别为碱性蛋白酶Aclase2.4L®与Flavourzyme®对RPSS吸油性的影响.由图6、7比较可知，两种蛋白酶对RPSS吸油性的影响表现出较大差异.碱性蛋白酶Aclase24L®水解RPSS ，随水解进行，RPSS吸油性显著降低，后有所提高，当水解度继续提高，RPSS吸油性又呈现降低趋势；而利用Flavourzyme®作用RPSS，RPSS吸油性却表现为先显著增大后降低的趋势，因此，采用Flavourzyme®并进行轻度水解(DH<1%)有利于提高RPSS吸油性.

图6 碱性蛋白酶Aclase2.4L®对RPSS吸油性的影响 图7 Flavourzyme®对RPSS吸油性的影响

3 结束语

蛋白酶水解可不同程度提高RPSS溶解性，其中，碱性蛋白酶Aclase2.4L®对菜籽蛋白溶解性影响较大，当DH>10%，菜籽蛋白溶解性大于SPI，且不受等电点影响；与SPI相比，RPSS吸油性较强，持水性较差；酶法水解不同程度降低RPSS持水性，而采用Flavourzyme®，适度水解(DH<1%)可显著提高RPSS吸油性.

参考文献

[1] 姜绍通，潘 牧，郑 志.菜籽粕贮藏蛋白制备及功能性质研究[J].食品科学，2009，30(8)：29-32.

[2] 郑美瑜，陈剑兵，陆胜民，等.菜籽蛋白的提取和纯化[J].农业工程学报，2008， 24(8)：267-270.

[3] 刘大川，周俊梅，张寒俊，等.低植酸、低单宁“双低”菜籽分离蛋白制备工艺的研究[J].中国油脂，2005，30(8):38-41.

[4] 严梅荣，鞠兴荣，王丹丹.碱提酸沉淀方法制取菜籽蛋白质的研究[J].中国粮油学报，2009，24(6)：72-75.

[5] 张寒俊，刘大川，王兴国，等. 双低油菜籽蛋白质及其他成分溶解曲线研究[J].中国油脂，2003，28(1): 27-29.

[6] 何 江，钮琰星，黄凤洪，等.菜籽浓缩蛋白研究进展[J].中国油脂，2009，34(10)：20-23.

[7] 蔡丽丽，陆启玉，钱 林.酶法改性食品蛋白质的研究进展[J].粮油加工与食品机械，2006，(6)：85-87.

[8] Lqari H.，Vioque J.，Pedroche J.，etal.. Lupinus angustifolius protein isolates chemical composition functional properties and protein characterization[J]. Food Chemistry，2002， 76:349-356.

[9] Adler-Nissen J. Enzymatic hydrolysis of food proteins[M].New York: Elsevier Applied Science Publishers，1986:9-56.