宋宏新， 胡围围， 薛海燕， 田 颖

(陕西科技大学生命科学与工程学院， 陕西 西安 710021)

0 前 言

鸡卵黄免疫球蛋白(Immunoglobulin of egg yolk，简称IgY)，又称鸡卵黄抗体，是母鸡血液中的免疫球蛋白传递至鸡卵黄并在子鸡孵育过程中和孵育后对子鸡起保护作用的免疫球蛋白.IgY具有成本低、安全、易大规模制备、不与人类补体结合以及不与类风湿因子结合等免疫学特性，现在已被广泛应用于免疫学诊断、医疗和食品检测等诸多方面[1-5].因此，特异性卵黄抗体的制备也引起了人们足够的重视，对IgY分离纯化的研究有着重要意义.本研究以大肠杆菌为免疫原，通过强化免疫技术，从免疫鸡卵黄中提取抗大肠杆菌抗体，研究了卵黄抗体的分离纯化工艺，为IgY的免疫分析和临床应用研究奠定了基础.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌种

大肠杆菌(本实验室保存).

1.1.2 实验动物

实验用120日龄产蛋鸡，隔离饲养一周，4只进行免疫，1只作为阴性对照.

1.1.3 试剂仪器

完全弗氏佐剂与不完全弗氏佐剂(美国sigma 公司)；标准鸡IgG及HRP酶标兔抗鸡IgG(北京新经科生物制品有限公司)；牛血清白蛋白(上海化学试剂公司)；过硫酸铵(天津市化学试剂六厂)；酶联免疫检测仪MK3 (WELLSCAN 芬兰)；混合纤维素酯微孔滤膜(上海兴亚净化材料厂)；752型紫外可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)；HC-2518R高速冷冻离心机(科大中佳)；亲和色谱柱(HiTrapTM IgY Purification HP柱体积5 mL)(美国通用电气公司).

1.2 方法

1.2.1 抗原制备

将大肠杆菌接入牛肉膏蛋白胨液体培养基中摇瓶培养，离心收集菌体，用生理盐水将菌体稀释得1.19×109CFU/mL菌悬液.100 ℃水浴灭活15 min，4 ℃保存.

1.2.2 鸡体免疫

将等量的菌悬液与佐剂混匀，充分乳化制成免疫原.每只鸡每次两翼双翅与胸部肌肉四点注射配制好的免疫原1 mL.首免利用完全弗氏佐剂乳化菌体，诱导其产生免疫应答，加强免疫使用不完全弗氏佐剂，每隔10～15 d加强免疫一次，最后一次不加佐剂免疫，共加强免疫3次，免疫过程收集卵黄进行效价检测.

1.2.3 IgY的提取与纯化

1.2.3.1 水溶性蛋白的提取

免疫后鸡蛋→弃蛋壳、蛋清→用7号针头刺破卵黄膜，让卵黄自动流入量筒，收集卵黄液18 mL→用蒸馏水按1∶8稀释卵黄液，混匀后，用0.1 M盐酸调pH 至5.2～5.3，搅拌10 min后于4 ℃过夜→采用0.45 μm的混合纤维素酯膜进行微滤(3%硅藻土助滤)，最后得水溶性组分(Water Solution Fration，简称WSF)100 mL.

1.2.3.2 两步盐析

取WSF 30 mL，往其滴加饱和硫酸铵使其终浓度为50%，4 ℃静置过夜，离心(10 000 r/min 15 min)，用等体积的0.01 M pH 7.4 PBS溶解沉淀，再加入14%(W/V)硫酸钠混匀，4 ℃静置过夜，离心(10 000 r/min 15 min)，收集沉淀并溶于3 mL 0.01 M pH 7.4 PBS.

1.2.3.3 亲和层析纯化IgY

样品预处理：盐析后的样品装入透析袋，平衡缓冲液A(20 mmol/L PBS，pH 7.4，含0.5 mol/L K2SO4)透析过夜，0.22 μm微滤膜过滤.

亲和层析过程：用5倍柱体积的平衡液A平衡亲和柱，流速为3.8 mL/min，压力为0.3 MPa，紫外检测器在波长为280 nm下进行检测，达到基线后取预处理样品1 mL上样，先用平衡液A冲洗柱子，IgY由于亲和作用结合在柱子上，而未结合的物质将随着A液流出，直到没有物质流出后，改用洗脱液B(20 mmol/L PBS，pH 7.4)冲洗柱子，出峰时用部分收集器进行收集.

1.2.4 抗体含量、纯度及活性测定

以牛血清白蛋白为标准蛋白[6]，通过考马斯亮兰G-250法测定制备的抗体的蛋白含量，而抗体纯度则利用SDS-PAGE方法，以标准鸡IgG作对照，通过电泳凝胶分析软件计算获得，电泳分离胶浓度与浓缩胶浓度分别为7.5%和3 %，电泳电场电压为120 V，电泳蛋白条带通过考马斯亮蓝R-250染色.最后，将各纯化步骤中得到的样品稀释至蛋白含量为0.5 μg/mL，采用间接ELISA法[7]测定制备的IgY与特异抗原的结合情况，以得到其在纯化过程中活性大小变化结果.

2 结果与分析

2.1 免疫效果

免疫后收集鸡蛋，提取并获得WSF后用间接ELISA法监测鸡蛋卵黄中IgY的效价情况，所得免疫应答曲线如图1所示.本研究中的抗原浓度为1.19×109CFU/mL，能激起有效的免疫应答，过低或过高可能导致免疫不明显或免疫耐受[7].实验结果表明二免后开始出现特异性抗体，此后抗体效价随免疫时间逐渐上升，高效价出现在四免后，最高效价可达1.6×105，此后效价幅度有所下降，但能保持在高效价水平上(>104)并维持2个月时间.

图1 lgY效价随时间的变化曲线 图2 IgY亲和色谱图

2.2 亲和色谱图

图3 SDS-PAGE图谱

图2为盐析后样品在免疫亲和色谱柱上的分离情况.从图中可以看出,上样后, 未被柱材料吸附的杂蛋白表现为色谱图的第一个色谱峰P1，出峰时间为78 s，峰高131.202 mAU.平衡缓冲液平衡至基线时, 改用洗脱缓冲液, 使抗体与亲和色谱柱的结合能力改变，从而将吸附在柱上的目的蛋白洗脱下来, 表现为图中的P2峰，出峰时间为10 min，峰高295.78 mAU，由图可知，其分离效果较好，能够使目的蛋白与杂蛋白得到很好的分离.

2.3 电泳结果

图4 分离纯化组分的效价

各纯化组分经电泳分析如图3所示.卵黄经水稀法初步分离，得到的WSF含有较多杂蛋白，WSF主要存在的蛋白包括IgY(γ活性蛋白、α活性蛋白、β活性蛋白和低密度脂蛋白).可以看到经50%饱和度(NH4)2SO4一步盐析后，杂蛋白有所减少，而经两步盐析后，基本可以除去大部分非γ活性蛋白部分，而经亲和层析得到的峰P2收集液为单点纯.

2.4 活性测定

通过间接ELISA方法，对纯化过程各步骤得到的阶段产物的活性进行了测定，相同蛋白浓度(0.5 μg/mL)不同阶段的IgY组分经间接ELISA过程测得的OD450值如图4所示，随着分离纯化的进行，其OD450值略有下降，这一现象表明在纯化过程中抗体的活性有一定程度的下降，但仍然具有很高的活性，该制备过程适合得到高活性抗体.

2.5 蛋白质含量，回收率及纯度测定

表1 各分离步骤所得蛋白质的含量及收率

注：蛋白质回收率 = 每步提纯后蛋白质总量/ 微滤液蛋白质含量.

测定水稀释提取样品，盐析后样品及层析后样品的蛋白质含量，计算得到蛋白质回收率，由电泳凝胶分析软件计算纯化后各样品的纯度，其结果如表1所示，水稀释提取的蛋白质回收率为100%，IgY纯度为15.38%，经过盐析后，卵黄中的大部分杂蛋白已除去，测得蛋白质回收率为49.5%，纯度高达89.9%.亲和层析后，蛋白损失的较多，只能得到1.05 mg/mL，但IgY纯度高达96.87%.

尽管亲和层析得到的抗体纯度高，但仪器昂贵，制备量少，只适合实验室研究与分析，而经过两步盐析得到的IgY的纯度也达到了很高的水平，更适用于抗体的大规模制备.

3 结束语

本实验表明，灭活的大肠杆菌菌体抗原成功的免疫了母鸡，制备了抗大肠杆菌的特异性IgY，免疫后抗体最高效价达1.6×105.本实验中采用水稀释卵黄使脂蛋白沉淀，经微孔过滤去除脂蛋白沉淀，采用盐析技术提取IgY并用亲和柱纯化IgY.在制备WSF后，用硫酸铵和硫酸纳两步盐析提取，纯度可达89.9%，回收率也接近50%，适合于IgY的大规模制备.用亲和层析后，纯度高达96.87%，蛋白质产率为25.8%，此法既简单，又方便操作，适合于实验室分析研究.

参考文献

[1] H Bade,H Stegemann.Rapid method of extraction of antibodies from hen egg yolk[J].Immunnol Methods,1984,72:421.

[2] Per Hansen,Judith A.Isolation and purification of immunoglobulins from chicken eggs using thiophilic interaction chromatography[J].Journal of Immunological Methodl,1998,215:1-7.

[3] Wu C,Yang R,Zhou J,etal..Production and characterization of a novel chicken IgYantibody raised against C-terminal peptide from human thymidine kinase 1[J].J Immunol Methods,2003,277(1-2):157-169.

[4] Mine Y,Kovaca-Nolan J.Chicken egg yolk antibodies as therapeutics inenteric infectious disease[J].Med Food,2002,(5):159-169.

[5] Elin N,Jorg H,Jonas B,etal..Proteomic characterization of IgY preparations purified with a water dilution method[J].Agric Food Chem,2008,56:11 638-11 642.

[6] 宋宏新，李敏康.现代生物化学实验技术手册[M].陕西：陕西人民出版社，2002:160-161.

[7] Ophidian P.Simple purification methods for anαgalactose-specific antibody from chicken eggs[J].Journal of Bioscience and Bioengineering,2001,91(3):305-310.