116021 解放军第210医院 刘亚萍 李溪 戴林

随着对应激机制研究的深入，人们发现应激时除有神经-内分泌以及相关的功能代谢改变外，还有细胞水平的变化。这种当细胞处于不利环境和遇到有害刺激时所产生的防御或适应性反应称为细胞应激，它存在于从单细胞生物到高等动物所有的生物体内[1]。

细胞应激可分为基因毒应激(由紫外线、离子射线、过多的活性氧、化学致畸及致癌物等引起)和非基因毒应激(由切应力、创伤、感染、缺氧和热应激等引起)两大类。细胞应激反应包括一系列高度有序事件，表现为应激原诱发的细胞内信号转导，激活相关的转录因子和促进应激基因的快速表达，合成多种特异性和非特异性的对细胞有保护作用的应激蛋白质，从而对细胞产生特异和非特异的保护作用，同时细胞内一些正常基因的表达受到抑制。

小G蛋白Rho亚家族是一类GTP酶结合蛋白，它通过其下游效应蛋白介导参与调控多种细胞生物学功能，涉及到细胞的骨架重组、生长、凋亡、运动等[2-3]。Rho亚家族成员主要有RhoA、RhoB和RhoC，虽然RhoB和RhoA、RhoC在结构上的相似性高达87%，但它在细胞内定位、不同细胞周期中的表达情况以及调控等许多方面都显示出其特殊性[4-5]。小G蛋白RhoB至今的研究表明其是一类GTP结合蛋白，只有与GTP结合的RhoB(活化的RhoB)才能激活下游的信号转导通路，进而发挥复杂多样的生物学效应[6]。RhoB属于即时反应基因，可被多种基因毒应激因素所诱导，诸如紫外线、化疗药物(如顺铂、5-氟尿嘧啶)等[7-8]，并能抑制某些肿瘤细胞增生和诱导细胞凋亡[9-10]。

1 紫外线(UV)对小G蛋白RhoB的诱导作用

紫外线照射属于基因毒应激，它是通过损伤DNA引起的细胞应激，紫外线依据波长一般分为UVA(320～400 nm)、UVB(290～320 nm)和UVC(240～290 nm)。其损伤DNA的机制：UVA主要通过其他分子产生活性氧间接损伤DNA的单个碱基；而UVB和UVC直接被DNA分子吸收，使DNA形成嘧啶二聚体，相邻2个T，相邻2个C，C与T之间均可形成二聚体，但最容易形成的二聚体是TT，结果使其不能与嘌呤配对而致DNA损伤。

Westmark等[11]发现，在分化细胞(NIH/3T3)和原代细胞(NHEK)细胞中，紫外线照射数小时后，RhoB上调，RhoB mRNA的半衰期较对照增加2～3倍，其是通过RNA结合蛋白类胚胎致死异常视觉1(HuR)结合到RhoB的3~-非翻译区(3~-UTR)而使RhoBmRNA的稳定性增强。在紫外线的照射下A18 hnRNP从核到胞质的易位，而YB1却移动到细胞核，同时HuR在胞质积聚。也就是说，UV诱导的转录后调节如甲基化和(或)磷酸化，HuR从核到胞质的穿梭运动，从而导致了ERGmRNA在胞质积聚的稳定。HuR以新的方式在细胞核结合转录后的ERGmRNA，通过核膜传输mRNA和蛋白的结合物，并且阻止了胞质中核糖核酸酶(RNase)的攻击信息的传递。Fritz等[12-13]发现当紫外线照射30min后，3～4倍增加的RhoBmRNA的半衰期可以被放线菌素D(Act D)阻断，这个转录激活过程不依赖p53和c-fos，但是需要完整的CCAAT RhoB的启动元件。因此，紫外线似乎可以激活RhoB基因的转录和转录后基因的稳定性，同样在NIH/3T3细胞中，Blattner等[14]也发现紫外线可以控制c-fosmRNA的转录和转录后水平。紫外线可能先激活细胞内的信号通路，然后快速的激活丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)家族的蛋白激酶，如ERK[15]、SAPK/JNK[16]、P38[17]、PI3K/AKT[18]，由它们构成二级信号通路。它们激活后可活化转录因子NF-κB，它是由激活IκB激酶(IκK)而特异性地磷酸化IκB，磷酸化的IκB与NF-κB解离，并迅速触发泛素-蛋白酶体途径而降解。NF-κB中的核定位信号由此得以暴露，能够进入细胞核，通过与κB增强子以及启动子相互作用而促进基因的表达。活化的胞外细胞调节激酶(ERK)可通过EIk1/TGF的磷酸化促进c-fos基因转录，JNK能使转录因子c-Jun N端转录活性区的Ser63和Ser73磷酸化，提高c-Jun的转录活性。JNK也可使p53蛋白磷酸化。Bruno Cangulihem[18]的研究表明，UVB能够诱导人角化细胞(HaCaT细胞)中RhoB的表达，RhoB的上调通过增加表皮生长因子受体(EGFR)的表达促进AKT的磷酸化(活化)，活化的AKT可抑制Bad和Caspase-9的活性而起到抑制凋亡的作用。

2 缺氧对小G蛋白RhoB的诱导作用

单纯性的缺氧或缺血、缺氧可导致缺氧性细胞应激，表现为缺氧作用于细胞上的氧感受器，启动细胞内的信号转导通路，激活作为转录因子的缺氧诱导因子-1(HIF-1)或HIF-1α样因子(HLF)。

细胞内氧的降低，也就是缺氧，存在于心脏病、急性和慢性血管疾病、肺部疾病和肿瘤中。哺乳动物细胞通过其保守的缺氧反应通路能感觉氧含量降低的水平，其也参与了生理方面的反应，如胚胎发育时期血管的形成及肿瘤的病理过程。尤其在肿瘤的发生发展过程和对放射疗法的抵抗方面，缺氧是一重要的选择力。HIF-1是基本的自身氧环境的调节器，其通过控制一系列的靶基因来参与血管增生、糖酵解、细胞增生和pH调节。HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β两个亚单位组成的异二聚体。由于HIF-1β是组成性表达，因此细胞内HIF-1α的水平依赖于氧的含量。在正常氧含量的情况下，HIF-1α是由氧依赖的特殊的脯氨酰羟化酶组成的脯氨酰羟化物，其需要氧、亚铁离子和2-酮戊二酸来激活。已经知道的有3种脯氨酰羟化酶，但是最近的研究表明脯氨酰羟化酶2是常氧状态下HIF-1α低水平状态下关键的氧传感器[19]。低氧时，脯氨酰羟化酶停止其功能，HIF从降解中解离出来。除此以外，缺氧信号转导也需要激酶/磷酸酶的激活。Wang等[20]的研究指出，在细胞治疗的时候用酪氨酸激酶抑制剂或苏/色氨酸抑制剂磷酸酶的抑制剂及氟化钠都可以阻断缺氧诱导的HIF-1α的表达。除此以外，PI3K/AKT信号通路调节缺氧诱导的HIF的激活[21]。例如，Zhong等[22]的研究表明，在用药理学物质治疗人前列腺癌细胞时，PI3K和AKT的靶基因抑制HIF-1α的表达。有活性的PI3K活化AKT后，依次的抑制糖原合成激酶(GSK-3)自身的Ser21和Ser9的磷酸化。另一方面，GSK-3的活性可以被Tyr279/Tyr216的磷酸化上调，最新的研究表明，这是细胞内的自磷酸化反应[23]。GSK-3第一次被提出可以调节糖原合成酶的活性，并且已经被证明其是糖原合成的负调节因子，还可以通过磷酸化调节许多转录因子。最近的研究表明，延长缺氧时间可以激活GSK-3β和降低HIF-1α蛋白，表明GSK-3β可以调节HIF-1α蛋白的稳定性[21-24]。缺氧时，HIF-1α的稳定性可以被许多小G蛋白所控制，包括RhoA、RhoB、Rac1和cdc42。Skuli等[25]的研究表明，在缺氧30min时，RhoB就激活了，表明RhoB可能是抵抗缺氧时的敏感器，它的激活会诱导缺氧诱导的信号转导通路，然后使肿瘤细胞适应自身的新环境。他还发现RhoB调节细胞内HIF-1α的水平是由于激活HIF-1α蛋白水解造成的，因此证明了缺氧时RhoB参与了蛋白酶依赖的HIF-1α的调节。缺氧时线粒体中ROS的含量会增加，ROS是缺氧诱导转录反应所必须的，缺氧时RhoB可以被ROS激活，其他的小G蛋白在缺氧时也可以通过ROS被激活。RhoB被ROS激活可能也通过特殊的GAP或GEF的调节，至于其准确的机制，目前尚不清楚，有待于进一步的研究。

3 Toxin A对小G蛋白RhoB的诱导作用

Toxin A来自艰难梭状芽孢杆菌，它是抗生素相关性腹泻的主要致病因子，它可以使Rho GTP酶失活[26-27]。RhoB是唯一的膜结合的，其局限在细胞膜和早期的内含体中[28-30]，它促进转化和细胞凋亡的过程可能是通过调节细胞表面受体的的胞内运输来完成的[31]。已有的研究表明DNA损伤诱导的凋亡尤其需要RhoB的参与，尽管RhoB不直接诱导凋亡。早期的研究表明，RhoB积极的参与细胞的增生，但是近期的研究表明RhoB更多是细胞凋亡的调节剂，而不是诱导剂。因此，RhoB成为抗肿瘤治疗过程中一个有希望的靶基因。

Gerhard等[32]的研究表明，Toxin A可以使RhoB蛋白持续上调，其在8 h达到稳定，可以持续24 h，但是由于RhoB的半衰期大约是2 h，因此，长时间上调的RhoB可能是由抑制RhoB降解的抑制剂造成的。但是抑制新蛋白合成的抑制剂放线菌素可以完全阻止RhoB的合成。当在稳定状态时加入放线菌素时，可以导致RhoB水平快速的下降。因此，在加入Toxin A 8 h后，其长期持续的新蛋白的合成和蛋白的降解，达到了平衡状态，在此情况下，RhoB起蛋白转换作用。因为RhoB是Toxin A的底物，它是直接由葡萄糖基化作用引起的失活，应该导致靶细胞中葡萄糖基化作用后失活的RhoB增加。可是意想不到的是，大量增加的RhoB只有部分是葡萄糖基化作用后的，仍有大约40%是未修饰的RhoB。实验表明，未修饰的RhoB至少有部分是激活的。在用Toxin A处理后的细胞中新合成的RhoB大部分定位于细胞膜，而不是内含体，这些胞膜上的RhoB没有发现RhoA信号通路的孤儿核作用的调节蛋白，这些就是激活了的RhoB。他们还发现RhoB的上调是由Toxin A糖基化后的Rac1引起的，其是通过阻断PI3K/AKT通路来完成的。总之，Toxin A可以通过p38 MAPK诱导小G蛋白RhoB的上调，上调的RhoB仅仅部分失活，大部分的RhoB激活，并形成下游的信号通路。因此，Toxin A不再完全是小G蛋白的抑制剂，它也可以激活小G蛋白，其可以有助于对Toxin的治疗方法。但是Toxin在体内引起的促反应仍有待于进一步研究。

综上所述，应激反应是个复杂的过程。表现为一种应激原常能同时或顺次激活几条信号转导通路，不同应激原可激活多条信号转导通路。激活的信号能促进转录因子表达和(或)提高其转录活性产生生物效应。转录因子之间存在相互促进或抑制的作用，其生物效应也可能相反。这表明应激反应在分子水平存在非常复杂的反应和巧妙的调控机制。至于小G蛋白RhoB至今的研究表明其是一类GTP结合蛋白，只有与GTP结合的RhoB(活化的RhoB)才能激活下游的信号转导通路，进而发挥复杂多样的生物学效应。已有的实验证实，应激对RhoB的影响不仅能够诱导其表达也能够使其活化[33]。至于应激诱导RhoB的机制和产生的生物学效应，不同的应激原其表现不同[34-35]，需要我们今后进一步的研究来阐明。

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