董飞侠，何立群，2，黄 迪，张新志

（1.上海中医药大学附属曙光医院肾内科、肝肾疾病病证教育部重点实验室，上海 201203；2.上海市高校中医内科E-研究院，上海 201203）

单侧输尿管节扎（UUO）模型作为经典的肾小管间质纤维化动物模型为学术界所公认［1-3］。但是UUO模型只能观察梗阻后肾组织的组织形态学变化，对于受损肾脏的功能难以评价，和临床实际遇到的输尿管梗阻以及不全梗阻患者治疗后解除梗阻后功能恢复以及病理形态好转的情况不相符合，鉴于此，建立一种既能观察梗阻后肾脏病理形态学变化又能研究其功能水平以及体现这二者之间的联系的新模型，为临床研发治疗肾纤维化药物提供新的研究对象显得尤为必要。通过反复研究和实践我们发明了单侧输尿管弹性塑胶加压结扎再通模型（获国家知识产权局专利号：200910057757.3），进一步发展和完善了研究肾小管间质纤维化的动物模型。

1 材料和方法

1.1 材料

健康SPF级雄性SD大鼠54只，体重200±20g，由上海中医药大学实验动物中心提供（动物合格证号0058668）。分笼饲养于12h光照，相对湿度45％左右的饲养笼中，动物自由饮水、摄食，室温喂养。弹性塑胶管由PVC材料自行制作，上海中医药大学附属曙光医院实验动物中心为标准的SPF级实验动物中心。

1.2 分组和造模

54只SPF级SD雄性大鼠，其中18只作为再通组（A组）；18只接受经典单侧输尿管结扎造成UUO模型（B组）；另18只为假手术组（C组）。再通组在接受左输尿管植入弹性管脂肪垫加压结扎梗阻后第7日后接受第二次手术，在第二次手术中，取出植入弹性管，疏通左侧输尿管，从而解除左肾梗阻，同时将右肾包膜分离，4号线结扎右侧输尿管。术后记录大鼠的生存状况、尿量。分别于术后第7和14日、21日各处死6只再通组大鼠、6只UUO组大鼠和6只假手术组大鼠，通过腹主动脉取血，监测肾功能水平，尿NAG，从而了解左肾功能，动态观察肾组织形态的改变。所有大鼠处死后取出左肾，去处包膜后纵行切开肾脏，进行肾脏大小、肾实质厚度测量，一部分肾组织固定后行病理检查、免疫组化染色（α平滑肌动蛋白）。

1.3 模型建立的评价方法

1.3.1 评价指标

1.3.1.1 肾功能的测定：血肌酐、尿素氮用常规生化测定方法检测。

1.3.1.2 肾小管功能的测定：尿NAG的测定：选用上海亚都生物技术经营部提供的尿NAG含量测定试剂盒，采用EL ISA法，用酶标仪测定，按试剂盒说明进行操作，步骤略。

1.3.1.3 大鼠的肾脏病理检测：用MASS ION染色，观察肾小球、肾小管和间质的病理变化。

1.3.1.4 免疫组化染色：α平滑肌动蛋白，采用SABC法。

1.3.1.5 肾小管间质纤维化指数：肾组织Masson特染，光镜观察。在PAS-9000高清晰度数码显微图像分析系统下计算肾小管间质纤维化指数。高倍镜（×200）下随机选取6个不重叠视野测定小管间质纤维化面积与同视野小管间质总面积的百分比，进行半定量评分。评分标准：0分：无病变；1分：＜25％；2分：26％～50％；3分：＞50％。每张切片取6个视野的平均积分，再在各组取平均值。

1.3.2 免疫组化结果分析：在每张切片不包含肾小球和血管的间质区域随机选取20个高倍镜视野（×200，HPF），用PAS-9000高清晰彩色病理图文报告分析系统对所选取视野中免疫组化阳性信号进行图像分析，计算每个视野中阳性染色面积占总视野面积的百分比，并计算其均值即平均面密度。

1.4 统计处理

2 结果

2.1 造模各组肾功能比较

造模14d后UUO组和再通组的肌酐、尿素氮都显著高于假手术组（P＜0.01），说明造模成功，并且再通组和UUO组Scr比较具有显著差异（P＜0.05）。造模21d后UUO组和再通组的肌酐、尿素氮都显著高于假手术组（P＜0.01）；同时再通组与UUO组相比有明显下降趋势，并且再通组和UUO组Scr比较具有显著差异（P＜0.05），造模28d后UUO组和再通组的肌酐、尿素氮都显著高于假手术组（P＜0.01）；同时与UUO组28d后相比再通组肌酐、尿素氮有明显下降趋势（P＜0.01），说明再通造模成功对肾功能恢复的优势（表1）。

2.2 造模各组尿NAG比较

再通组的尿NAG呈动态变化，随着再通时间的增加，尿NAG排出逐渐减少，证明肾小管功能的逐步恢复，而UUO组的尿NAG逐步增高，证明肾小管功能在逐步恶化加重。再通组分别与UUO组14、21、28d比较尿NAG都差异显著（P＜0.01）。证明再通组更有利于肾小管功能恢复（表2）。

表1 再通组以及UUO组造模后肾功能14d、21d和28d动态改变Tab.1 RUUO group and UUO group renal function 14d，21d and 28d dynamic state range

表2 再通组以及UUO组14d、21d和28d尿NAG动态变化Tab.2 RUUO group and UUO group urine NAG 14d，21d and 28d dynamic state range

2.3 造模各组肾纤维化指数变化

UUO组和再通组和假手术组比较均差异极显著（P＜0.01）。随着再通7d、14d、21d模型组肾纤维化指数逐渐减低，纤维化程度逐渐减轻，14d和UUO组比较虽有差别，但差异不显著，21d和UUO组比较差异显著（P＜0.05），28d和UUO组比较差异极显著（P＜0.01）。说明随着梗阻解除再通组的肾脏病理有明显的好转，且与肾小球和肾小管的功能恢复相一致（表3）。

表3 再通及UUO组肾小管间质纤维化指数14d、21d和28d动态变化Tab.3 RUUO group and UUO group renal tubule and interstitial fibrosis index 14d，21d and 28d dynamic state range

2.4 造模各组肾组织α-SMA的变化

造模14d、21d和28d后UUO和再通组的α-SMA显著高于假手术组（P＜0.01），说明肾组织有显著的纤维化表现。而在再通造模14d、21d和28d后和UUO组比较α-SMA有显著下降（P＜0.01）（表4）。

表4 再通组以及UUO组α-肌动蛋白14d、21d和28d动态变化Tab.4 RUUO group and UUO groupα-SMA 14d，21d and 28d dynamic state range

2.5 造模后各组病理变化（图1～8见彩插7）

假手术组，Masson染色显示肾小管间质未见明显病变（图1，图2）。UUO术后第14天，Masson染色显示肾组织出现炎性细胞浸润，主要为单核巨噬细胞及淋巴细胞，肾间质水肿，部分小管消失，集合管，远曲小管扩张呈囊状，管腔内可见脱落坏死的上皮细胞，远端肾小管扩张，间质纤维化轻（图3）。再通组术后14d，Masson染色显示部分近端小管保存尚好，肾组织出现炎性细胞浸润但是较UUO模型组明显减少。部分近端肾小管扩张程度轻，部分集合管，远曲小管扩张呈囊状但未见小管空泡变性，纤维化程度较UUO组术后14d轻（图4）。UUO术后第21天，Masson染色显示肾组织出现炎性细胞浸润，主要为单核巨噬细胞及淋巴细胞，肾间质水肿，部分近端小管扩张，管腔内可见脱落坏死的上皮细胞，远端肾小管扩张，中度肾间质纤维化（图5）。再通组术后21d，Masson染色显示部分近端小管上皮细胞空泡变性，管腔内可见脱落坏死的上皮细胞，未见小管萎缩消失，集合管，远曲小管病变程度较轻，肾间质纤维化轻（图6）。UUO术后第28天，Masson染色显示片状分布的肾小管萎缩和扩张，损伤萎缩肾小管周围见到代偿性肥厚扩张的肾小管，肾小管出现动脉硬化样改变和不同程度的肾间质单核细胞浸润。部分小管萎缩消失，重度肾间质纤维化（图7）。再通组术后28d，Masson染色显示部分近端小管保存尚好，未见远端肾小管扩张，未见肾小管空泡变性，肾间质纤维化程度较轻（图8）。

2.6 造模后各组α-SMA变化（图9～16见彩插7）

α-SMA免疫组化染色见阳性物质呈棕黄色，阴性对照组未见棕黄色颗粒在肾小管间质的沉积（图9，图10）。UUO组α-SMA在14d时，在肾小管间质有明显棕黄色颗粒样物质表达，随着梗阻时间的延长，UUO组α-SMA在21d和28d时棕黄色颗粒样物质表达逐渐增多，表达部位主要在肾小管间质（图11、图13、图15）。在各对应时间点上，RUUO组棕黄色颗粒样物质表达逐渐减少（图12、图14、图16）。RUUO组α-SMA的表达较UUO组轻，统计学分析有显著性差异（P＜0.01）。

3 讨论

临床中因为输尿管梗阻或者不全梗阻导致的肾纤维化时有发生，然而对于肾纤维化的治疗至今缺乏有效的办法。同时目前的研究已证实，肾间质纤维化程度与肾功能减退的相关性比肾小球病变与肾功能减退相关性更为密切。单侧输尿管节扎（UUO）模型制作相对简单，有较好的重复性，肾间质纤维化发生迅速，是目前公认的研究肾间质纤维化发生机制，肾小管上皮细胞转分化的理想模型，但是由于梗阻导致肾纤维化的不可逆性，所以观察药物干预治疗效果就存在较大的局限性［4］。而单侧输尿管弹性塑胶加压结扎以及再通模型既能观察梗阻后肾脏病理形态学变化又能研究其功能水平以及体现这二者之间的联系的新模型，为临床研发预防和治疗肾纤维化药物提供新的研究对象。

单侧输尿管梗阻后，肾实质受压，局部血流量降低，使肾小管缺血，变性，萎缩，甚至消失。损伤的肾小管又是多种炎症和促纤维化因子的主要来源，促进和加重了肾间质纤维化的发生［5，6］。我们的研究发现，进行UUO术后第7天，梗阻侧肾组织即出现单核巨噬细胞及淋巴细胞浸润，间质水肿，部分近端小管上皮细胞空泡变性，管腔内可见脱落坏死的上皮细胞，远端肾小管扩张。第14天，炎性细胞浸润及增殖更为明显，部分小管消失，集合管，远曲小管扩张呈囊状，皮质变薄，出现间质纤维化。第21天，大量炎性细胞浸润及细胞增殖，皮髓质变薄，间质纤维化进一步加重。第28天，炎性细胞浸润有所减少，皮质极薄，部分小管萎缩消失，纤维化显著，而实验过程中肾小球病变均不明显。进行肾小管损害程度及肾间质纤维化定量分析显示：随着梗阻时间的延长，肾小管损害的比率及肾间质纤维化程度呈现动态加重的过程。而再通组则和UUO相反，呈现动态好转的过程。

观察UUO术后梗阻侧肾脏外观发现，随着梗阻时间延长，UUO组梗阻侧肾脏显著增大肿胀，出现严重积水，表面不平，灰红相间，包膜显著增厚，而在再通组对应时间点上，再通侧肾脏肿大及积水程度较轻，色泽较红润，说明再通可以改善梗阻肾积水及肿胀程度。术后第14天，由于梗阻后的早中期病变是以炎性细胞浸润，间质水肿，小管扩张为主（图3）。再通组病变较轻（图4）。UUO术后第21～28天，随着肾盂积水的加重，肾实质逐渐变薄，间质纤维化加重（图5，图7）。再通组肾盂积水的减轻，肾实质逐渐变厚，间质纤维化逐渐恢复（图6，图8）。统计学比较有显著性差异。手术后第14天UUO组的血尿素氮、肌酐值开始升高，第21～28天，血尿素氮、肌酐值反而下降并基本恢复正常，这可能与尿路梗阻后引起肾小球囊内压增高，肾脏局部血流动力学紊乱，导致肾小球虑过率下降有关，并提示急性单侧输尿管梗阻后，大鼠肾功能有一个急性失代偿逐渐过渡到对侧肾脏代偿的过程。而再通组肾功能呈现动态好转的过程。提示7d造成的早中期肾纤维化是可以部分逆转的［7］。由于本模型研制成功为进一步研究肾纤维化逆转时间窗口进行有效的药物干预或找到不可逆转的肾纤维化时间点成为可能。

UUO术后梗阻侧肾脏出现了一系列病理变化。UUO组肾小管间质纤维化损害随着时间的延长，逐渐纤维化，直到终末期。再通组在各时间点的肾小管损害和间质纤维化程度要显著低于UUO组，再通组肾小管间质纤维化损害随着时间的延长，逐渐好转。说明再通组能改善输尿管梗阻后的小管间质损害，和UUO组比较呈现一个动态好转的过程［8］。

在UUO模型中，肾间质成纤维细胞迅速增殖，部分肾小管上皮细胞还可发生细胞表型转化成为肌成纤维细胞，产生大量α平滑肌动蛋白（α-SMA）。本研究免疫组化显示：两组相比，UUO组α-SMA的表达随病程进展逐渐增加。而再通组α-SMA表达在各个时间点上均显著低于同期UUO组。统计学分析差异有显著性（P＜0.01），提示再通组肾间质纤维化的逆转可能与下调α-SMA的表达有关。综上所述，从外观上看，再通组可以改善梗阻肾积水及肿胀程度，病理改变显示，再通组可以明显减轻肾小管间质的损伤程度及间质纤维化程度及淋巴单核细胞的浸润，并能下调α-SMA的表达，结合病理的好转，再通组肾功能也相应好转。为临床和实验药物研究肾小管间质纤维化提供了一个理想的早中期肾纤维化实验动物对象［9，10］。

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