杜淑娟，彭贝如，程树军，陈秀梅

（1.广东省中医院，广州 510120；2.广东出入境检验检疫局技术中心，广州 510620）

抽动-秽语综合征（tourette syndrome，TS），又称多发性抽动症，是一种儿童期起病的慢性神经精神障碍性疾病。临床表现主要为突然、快速、反复、非节律性、不自主和刻板的运动性抽动和发声性抽动。还可能伴有各种行为紊乱、强迫观念与行为、认知障碍等，可不同程度的干扰和损害儿童的认知功能，影响社会适应能力。本病病因尚未明确，具有明显的遗传倾向。本病多见于4～12岁的儿童，患病率约为0.05％～3％，近年来发病呈明显上升趋势［1］。

近年来研究提示TS是一种儿童神经精神障碍的概念，其病因可能是由于遗传、神经自身免疫和感染、环境作用等多种复杂因素在发育过程中相互作用的结果。目前医学界对TS的病因和发病机理还不完全清楚，其中最重要的原因是动物模型的开发和应用不能满足基础与临床研究的需要［2］。本实验应用亚氨基二丙腈腹腔注射建立的抽动-秽语综合征模型大鼠，研究模型大鼠行为学、海马神经元、脑组织多巴胺含量等指标，为本病的基础和临床研究提供实验动物模型支撑。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：SPF级SD大鼠60只，28～30d龄，体重250±10g，雌雄各半（广东省医学实验动物中心，粤监证字2008D006，批号：0037766）。

1.1.2 实验药品：亚氨基二丙腈（IDPN），购自Alfa Aesar公司（批号：C7323A），将IDPN溶解于生理盐水，配制浓度为100mg/mL的稀释液避光保存备用。

1.1.3 仪器与试剂：LC26A型高效液相色谱仪、SPD26AV荧光检测器、C2R4A数据处理机均为日本岛津产品。脱水机、包埋机、切片机和生物显微镜等病理设备为德国Leica产品。微量组织匀浆器为Millipore公司产品。高氯酸、EDTANa2、SDS、H2SO4均为分析纯，甲醇为色谱纯。对照品由中国药品生物制品所提供。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制作：参考Wakata［3］的方法，给药前对每只动物行为评分，将SD大鼠随机分成2组，对照组和造模组各20只，每组均雌雄各半。造模组腹腔注射IDPN，每天150mg/Kg体重，对照组注射生理盐水。每天1次，连续7d。

1.2.2 大鼠行为观察：参考采用观察评分，每日一次，每次至少观察1h，主要诱发症状分为运动行为和刻板运动两类。（1）运动行为评分，0分：安静或正常活动；1分：过度兴奋；2分：探究行为增加，不连续的吸鼻声；3分：不停跑动；4分：不停跑动伴有惊跳；（2）刻板运动（或定型运动）评分，0分：无刻板运动；1分：躯体旋转行为（顺时针或逆时针的旋转运动）；2分：头和颈部的上下运动过多（头颈部与地面垂直方向的一种异常运动）；3分：头、颈部的上下运动过多加旋转行为；4分：头向侧摆，合并头和颈部的上下运动过多。

1.2.3 神经递质分析：第14天将所有实验大鼠迅速断头处死，取右脑海马组织及边缘系统（包括纹状体、隔核、层壳核、基底节、齿状回），精确称重，置入1mL处理液（含0.1mol高氯酸和0.05％EDTANa2）中，微量组织匀浆器冰溶下匀浆，4℃冰冻离心10000r/min，取上清液置入-20℃保存，参考刘师莲等［4］的方法采用液相色谱法测定多巴胺（DA）和去甲肾上腺素（NE）浓度。测样时，室温下解冻，进样20μL，以峰面积外标法定量。

1.2.4 组织学观察：留取左侧脑组织，剥离海马及周边组织，用4％多聚甲醛的0.1mol/L PBS溶液固定，常规石蜡包埋，连续冠状切片，厚度5μm，分别做HE和TH染色。光学显微镜下观察海马细胞形态变化。每只大鼠取6张连续冠状切片，分别计数左侧海马各区神经元数。

1.2.5 数据统计：选用软件SPSS13.0和SAS9.1.3版本进行统计学处理和分析。采用均数±标准差进行统计描述，进行模型组与对照组行为学评分、神经递质分析和组织病理学观察。

2 结果

2.1 行为学观察和评分

亚氨基二丙腈注射液腹腔注射7d后，无动物死亡或出现严重体重下降、精神萎靡等症状。注射3d时，造模组部分动物出现过度兴奋、探究行为增加（运动行为评分2.1±0.3），头和颈部出现大量舞蹈样运动，夹杂头部快速抽动样的惊跳，躯体旋转行为和头颈部的上下运动明显增多（刻板运动评分2.3±0.4），摄食量开始下降；造模7d时全部动物出现不同程度的异常跑动和惊跳（评分4.0±0.1），头颈部频繁地不自主上下运动和旋转（评分3.9±0.3），且持续时间较长；停药后至14d时，上述症状仍维持稳定。对照组未见类似行为变化，提示造模成功且稳定。

2.2 脑组织DA、NE含量

造模14d时，大脑海马及周边区域两种神经递质检测结果，造模组DA和NE含量分别为（60.7±20.4）μg/g和（74.8±23.9）μg/g，空白组DA和NE含量为（188.4±59.2）μg/g和（46.8±17.3）μg/g，两种递质统计学差异极显著，提示模型大鼠脑组织存在低多巴胺及高去甲肾上腺素状态。

2.3 组织学观察

组织学观察结果显示，对照组海马CA2区锥体细胞呈多角形排列紧密整齐，树突明显，未见炎症细胞浸润和神经元空泡变性和坏死，门区锥体细胞排列不规则，齿状回颗粒细胞呈圆形紧密排列，细胞充盈，细胞核居中，染色均匀，形态清晰，树突的棘清晰可见。模型组海马CA2区锥体细胞排列紊乱，数量减少，部分细胞出现空泡变性，大量细胞出现核固缩坏死，门区锥体细胞排列紊乱，大量神经元细胞肿胀、核固缩坏死，由典型的多角形变为三角形或不规则形，周边胶质细胞浸润，顶树突明显减少，排列混乱；齿状回神经元坏死，大部分颗粒细胞浓缩、深染，细胞数量明显减少，排列疏松（图1，彩插6）。空白组海马酪氨酸羟化酶免疫反应阳性神经元成群分布，模型组胞浆内阳性反应颗粒明显减少，有的神经元阳性颗粒完全丧失。

2.4 海马神经元细胞计数

造模组与空白组相比，海马各区及齿状回神经元数量显著下降（P＜0.05），提示造模导致神经元数量明显减少（表1）。

表1 海马各区及齿状回神经元细胞计数（/250μm2）Tab.1 Neuron counter of hippocampi region and dentate gyrus（/250μm2）

3 讨论

3.1 行为学特征

动物表现出的症状很难完全等同于人类TS的综合表现，因此需要准确地界定动物的行为与TS的精神运动症状的相同性。本文按照TS的诊断标准将行为异常分为两类4级进行评分［5］，定量判定造模型过程中行为异常的变化情况，从中筛选出与人类抽动类似的行为特征。结果表明，IDPN诱发TS模型大鼠出现明显刻板运动和运动行为异常，如过度兴奋、探究行为、异常跑跳、旋转行为、头颈部上下侧摆等动作均具有特征性，有时出现的连续的嗤鼻、抬举上肢等动作，类似于人类TS患儿喉部发声、耸肩等特征动作，而且停止给药后行为症状仍持续维持。表明在行为学上该动物模型很大程度上模拟了TS的客观行为特征。

3.2 神经生物学特征

虽然目前对TS的神经生物学物质基础还未完全阐明，但基本认为中枢神经递质，特别是DA、NE、5-HT等与TS之间关系密切［6，7］，因此，探讨大脑多巴胺类神经递质及其代谢产物的水平既是了解TS发病机制和发病部位的关键因素，也是证明模型可靠性的重要指标。本模型通过大脑海马区DA和NE的测定结果表明，造模型后DA明显下降，而NE水平有所升高，这与Wakata等检测到IDPN造模后脑区DA下降的结果类似［3］。神经生物学特征的模拟为下一步探讨造模型过程中此类递质的动态变化奠定了基础。

3.3 组织形态特征

通过实验大鼠的脑组织病理切片和免疫组化观察，发现大脑海马区神经元结构及数目出现明显病理性改变。TS主要累及海马及周边核团（尾壳核、隔核、纹状体）神经元的功能［8］。本试验从组织学层面表明了IDPN诱发的动物模型具有退行性神经组织病变的特征。选择刚成年大鼠则可以提高模型易感性和接近儿童患病的实际情况。

迄今为止，还没有一种动物模型能完全复制人类多发性抽动症的所有症状和特征，本文以IDPN腹腔注射诱发大鼠建立抽动-秽语综合征模型，初步表明具备与本病相关的神经生物学、行为学和病理学特征，为以后开展基础研究和包括中药在内的药物治疗研究提供支撑。

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［2］Swerdlow NR，Sutherland AN.Using animal models to develop therapeutics for tourette syndrome［J］.Pharmacol Ther，2005，108（3）：281-293.

［3］Wakata N，Araki Y，Sugimoto H，et al.IDPN-induced monoamine and hydroxyl radical changes in the rat［J］.Brain Neurochem Res，2000，25（3）：401-404.

［4］刘师莲，张兆莲，刘贤锡，等.大鼠脑组织单胺类递质及其代谢产物的检测方法研究［J］.山东大学学报（医学版），2002，40（5）：472-475.

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