任崇仁，鲍民生，曹杜娟

（山西医科大学第一临床医院，太原 030001）

门脉高压症食管静脉曲张破裂出血在临床上屡见不鲜，是治疗的重点难点。NO过多产生被认为是门脉高压食管静脉曲张的主要原因之一［1］，有文献报道非选择性的一氧化氮合酶抑制剂通过降低NO浓度可改善门脉高压大鼠食管静脉曲张［2］。

目前发现可以合成NO的酶即总一氧化氮合酶（TNOS）共有两类：一类为组织型（cNOS），主要负责基础NO的合成，生理状态下即表达，调节各种生理功能；另一类为诱导型（iNOS），生理状态下不表达，受到如内毒素等的刺激时催化合成非生理浓度的大量NO，产生一系列病理作用［3］。国外学者发现在门脉高压大鼠的食管黏膜中iNOSmRNA比cNOSmRNA增多更显著［4］。推测iNOS产生的大量NO在大鼠门脉高压症食管静脉曲张的发病过程中可能发挥了重要作用。

本实验研究iNOS的特异性抑制剂S-甲基异硫脲（S-methylisothiourea，SMT）对肝前性门脉高压大鼠食管静脉曲张的影响，以探讨iNOS在食管静脉曲张发生中的作用，以及使用iNOS抑制剂SMT治疗食管静脉曲张的可能性。

1 材料和方法

1.1 材料

健康雄性SD大鼠60只，体重220～250g，由河北医科大学实验动物中心提供［SCXK（冀）2008-1-003］；S-甲基异硫脲（S-methyl isothiourea，SMT）购自美国Sigma公司；一氧化氮合酶测定试剂盒（分型）、一氧化氮试剂盒（硝酸还原法）购自南京建成生物工程研究所；CD34免疫组化试剂盒购自北京博奥森生物科技公司。上海光谱仪器有限公司产SP721E型分光光度计，MiaS-2000型图像分析仪，欧林巴斯BX51光学显微镜。

1.2 方法

1.2.1 实验动物造模和分组：大鼠随机分为5组：①假手术组（n=12）：仅分离门静脉主干和左侧肾上腺静脉，不结扎，余步骤同模型组；②模型组（n=12）：采用尹朝晖等介绍的方法门静脉两步法结扎加左肾上腺静脉结扎制备大鼠门脉高压食管静脉曲张模型［5］，手术24h后，每日给予腹腔注射生理盐水0.5mL/100g一次，共20日；③低剂量SMT干预组（n=12）：手术同模型组，手术24h后，每日给予腹腔注射浓度为5mg/mL的SMT溶液，0.5mL/100g一次，共20日；④中剂量SMT干预组（n=12）：手术同模型组，手术24h后，每日给予腹腔注射浓度为10mg/mL的SMT，0.5mL/100g一次，共20日；⑤高剂量SMT干预组（n=12）：手术同模型组，手术24h后，每日给予腹腔注射浓度为20mg/mL的SMT，0.5mL/100g一次，共20日。

1.2.2 门脉压力测定：大鼠术后21d，腹正中线开腹，经回盲静脉插入一根充满生理盐水的硬膜外导管至门静脉，提起硬膜外导管远端，以鼠右心房水平为“0”点。测门静脉压力。

1.2.3 门脉取血、组织石蜡切片HE染色：门静脉采血3mL，离心机2000r/min，离心20min，取血清放入液氮罐冻存待测。取食管与胃交界处以上0.5cm的食管标本，置入福尔马林溶液中固定，常规石蜡包埋，同一标本两份5μm横截面切片，一份切片行常规HE染色。

1.2.4 利用血管内皮细胞表面特异表达CD34原理免疫组化SP法标记血管内皮：另一份切片在67℃烤箱中烤20min，放入二甲苯中脱蜡至水、采用热修复30min，一抗为兔抗鼠CD34IgG抗体冻干粉，稀释为100μL的浓缩液-20℃存放。浓缩液用PBS×1稀释为1∶150，尽量现配现用，二抗为生物素标记的羊抗兔IgG抗体，37℃孵育30min效果好，DAB显色2min左右，显微镜下观察适时终止，其余步骤按说明书依次操作，苏木精复染，脱水透明封片。

1.2.5 测定门脉血中TNOS活性、iNOS活性和NO浓度：按要求将试剂盒中的试剂配好，从液氮罐中取出血清放入4℃冰箱融化，其余步骤按说明书操作。分光光度计蒸馏水调零，TNOS活性与iNOS活性在530nm处，1cm光径，测各管的吸光度值；NO浓度在550nm，0.5cm光径，测各管的吸光度值，计算测定结果。

1.2.6 图像分析：在光学显微镜下观察HE染色食管黏膜、黏膜下层、肌层以及浆膜各层的改变。图像分析仪分析食管免疫组化结果：（l）黏膜下直径大于20μm血管的数目；（2）黏膜下直径大于20μm血管的总截面积；（3）黏膜下直径大于20μm单一血管的平均截面积即黏膜下血管总截面积与黏膜下血管数目比值。

1.2.7 统计学处理：应用SPSS11.5统计软件进行数据分析，结果采用均数±标准差（±s）表示，数据行正态性检验，组间行方差齐性检验，满足条件采用单因素方差分析，不满足则采用Kruskal-Wallis检验，组间差异均采用Bonferroni法分析进行两两比较。

2 结果

二次完全阻断门脉后存活大鼠，假手术组11只、模型组6只、低剂量组6只、中剂量组7只、高剂量组6只。

2.1 门脉压力，组织HE染色切片

假手术组大鼠门脉压力（11.45±2.1）cm H2O，模型组大鼠的门脉压力为（22.43±2.44）cm H2O，低剂量组大鼠（18±3.37）cm H2O，中剂量组（17.6±2.54）cm H2O，高剂量组（17.44±2.94）cm H2O，模型组大鼠的门脉压力显著高于用药各组（P≤0.01），但是用药各组的门脉压力依然高于门脉高压的诊断标准16cm H2O［6］。组织切片可见模型组黏膜下静脉和食管浆膜外经脉严重迂曲扩张，数量增加，静脉横截面积增大，部分极度扩张的黏膜下静脉向食管腔内隆起，低剂量组与模型组类似症状略有减轻，中剂量与高剂量组食管曲张不明显（图1，彩插6）。

2.2 门脉血中TNOS、iNOS的活性、NO的含量

TNOS的活性统计结果表明模型组显著高于其他各组（P＜0.01）；低剂量组明显高于剩余3组（P≤0.01）；假、中与高三组之间差异不显著。iNOS的活性统计结果表明模型组显著高于假、中和高三组（P＜0.005），假、中和高三组之间差异不显著。NO的浓度统计结果表明模型组与低剂量组显著高于其他三组（P＜0.01），模型组与低剂量组差异不显著，假，中和高三组之间差异不显著（表1）。

表1 门脉血TNOS、iNOS的活性和NO的含量Tab.1 TNOS activity，iNOS activity，NO content in portal blood

2.3 免疫组化CD34标记食管血管内皮，图像分析

血管数目统计结果表明模型组与低剂量组显著多于其他各组（P＜0.01），模型组和低剂量组差异不显著，假、中与高三组之间差异不显著。血管平均截面积统计结果表明模型组显著大于其他各组（P＜0.01）；低剂量时已经出现一定改善作用，但仍高于除对照外的其他各组（P＜0.01）；假、中与高三组之间差异不显著。血管总面积统计结果表明模型组显著大于假、中和高三组（P＜0.005）；假、中与高三组之间差异不显著，可见低剂量组已经在血管总面积表现出一定的改善作用（表2）。

3 讨论

本研究显示造模大鼠给予不同浓度SMT后，中剂量组与高剂量组大鼠门脉血TNOS、iNOS的活性以及NO的浓度较模型组明显下降，食管黏膜下血管的数目、单一血管的平均截面积及血管总面积等食管静脉曲张症状比模型组明显减轻。实验结果显示SMT可以降低门脉高压症食管静脉曲张大鼠的NO浓度，改善大鼠门脉高压食管静脉曲张状况。在本研究中我们同时观察到中、高剂量组门脉血中NO浓度与假手术组差异不显著，表明在门脉高压食管静脉曲张病中高水平的NO主要产生自iNOS，SMT在抑制门脉血中高水平的NO方面，可以取得与非选择性的一氧化氮合酶抑制剂同等的效果。

表2 食管黏膜下血管的数目，平均截面积和总面积Tab.2 The number，the average cross-sectional area，total area of esophageal submucosal blood vessels

分析本实验结果我们认为S MT作用机制可能为，门脉高压时由于肠黏膜屏障的损坏，门体静脉侧支循环的形成和门体分流异常，肠源性的内毒素与IL-1、TFNα等炎症因子大量进入体循环，导致内毒素血症的发生。内毒素与IL-1、TFNα等炎症因子能刺激iNOS基因转录、表达、合成和释放大量NO［7］。NO具有强大的舒血管特性，同时还介导门脉高压内脏血管对内源性缩血管物质的低敏感性［8］，以及能使血管括约肌舒张引起血液淤滞等因素共同促进了食管静脉曲张的发生和演绎。而正是由于SMT能够抑制iNOS合成非生理浓度的大量NO，降低NO的水平从而缓解了门脉高压食管静脉曲张病程进展。

在实验中我们也发现SMT并不能将门脉压力降到诊断标准以下，这与张丕利等的研究结果一致［9］。资料显示在各种液递物质之间存在一种平衡，当NO减少时其他血管活性物质会相对的增加以保持压力的相对平衡。

非选择性的一氧化氮合酶抑制剂对大鼠食管静脉曲张具有一定保护作用［2］，但该方法用于临床治疗有许多理论上难以解决的问题。非选择性的一氧化氮合酶抑制剂的非特异作用可能对机体生理调节所必须的NO产生干扰，如以L-NAME抑制内源性NO合成可明显增强胃黏膜对损伤因子的易感性［10］。而从理论上选择性的iNOS抑制剂则可避免这种干扰，我们的实验证明SMT同样对大鼠食管静脉曲张具有一定保护作用。当然选择性的iNOS抑制剂用于临床仍然也有许多问题尚待进一步探讨，如用药组的生存率在本实验中并无提高以及高剂量组大鼠腹腔出现脓毒症等现象。但不管怎样，本研究结果为今后选择性iNOS抑制剂类药物应用于临床提供了重要的实验依据。

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