张 琦，张中海，钟照华，朱孝荣

（1.徐州医学院，徐州 221004；2.哈尔滨医科大学，哈尔滨 150081）

克山病（Keshan disease，KSD）是一种原因不明的地方性心肌病，因发现于黑龙江省克山县而得名，目前认为其病因中有很重要的一条就是饮食中微量元素硒的缺乏［3］。低硒是个普遍关注的问题，全球许多地区的癌症死亡率与血硒浓度呈负相关，人体血硒含量长期低于0.1ppm可引起肝坏死、心肌损害、癌症和关节炎等疾病［5～7］。

但是到目前为止，低硒如何影响心肌细胞并导致心肌病的确切机制仍不清楚［8］，除了流行病学证据外，我们还无法从细胞和分子生物学角度清晰地认识低硒与克山病发生的关系。多数关于低硒的研究集中在含硒蛋白在氧化应急调节、抗肿瘤等领域。

为了进一步研究低硒导致心肌病的具体机制，建立低硒的动物模型是非常必要的，本课题组尝试用克山病高发地区-黑龙江省的地产酵母制作低硒饲料，以建立低硒鼠的动物模型。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：3周龄BALB/c鼠，购自徐州医学院实验动物中心［SCXK（苏）2005-0005］。

1.1.2 低硒饲料及其配制方法：酵母（Torula yeast）购自哈尔滨马利酵母厂。混合维生素（vitamin mix）与甲硫氨酸（DL-methionine）购自GIBCO公司。玉米油（corn oil）购自大润发超市。其余试剂均为国产分析纯；低硒饲料根据美国Harlan Teklad公司的TD 92163产品配方进行配制，配方为（g/kg）：Torula yeast 300.0g、DL-methionine 3.0g、sucrose 591.0g、corn oil 50.0g、mineral mix 35.0g、CaCO311.0g、vitamin mix 10.0g。

1.1.3 普通饲料及其配制方法：使用小麦等代替低硒饲料中的酵母（Torula yeast）和蔗糖；配方为（g/kg）：小麦530.0g、大麦182.5g、全脂乳粉50.0g、脱脂奶粉50.0g、鱼粉30.0g、骨粉30.0g、盐（含碘）8.5g、鱼肝油10.0g。

首先，福建省仅有一所招收聋人大学生的高等院校，且办学层次为专科，这与八、九十年代就开始招收聋人大学生的长春大学、天津理工大学、郑州工程技术学院等本科院校相比，发展迟、经验少、规模小、办学层次低。其次，福建省仅招收两个听障专业，虽然这两个专业符合聋人的特点和需求，但是专业面窄、可选择少，且全国20多所招收聋人大学生的其他院校基本上也都有这两个专业，专业的重复建设使得竞争优势不大且市场需求趋于饱和。由于缺乏经验，学校仍以管理健听生的方式来管理和要求系部，系部管理人员及教师等被大量的事务性工作所累，疲于应对各种建设、检查等，缺乏精力专心、深入地研究聋人教育事业。

1.2 方法

1.2.1 低硒小鼠模型的建立：纯系BALB/c乳鼠（雌雄各半）购自徐州医学院实验动物中心。共分5组，每组15只小鼠。两组低硒组，一组对照组，这三组雌雄分笼，实验观察动物的活动状况、饮食与体型变化，从第16周开始每周对老鼠进行称重并记录。其余两组分别为繁育对照组和繁育低硒组，均雌雄合笼，观察小鼠的繁殖次数。对照组和繁育对照组均使用普通饲料喂养；低硒组和繁育低硒组，使用低硒饲料喂养。实验前小鼠均先使用普通饲料喂养适应3d，实验期间小鼠自由进食，饮用水为ddH2O。

1.2.2 硒水平的测定：在第18周，取低硒组和对照组的Balb/c鼠各一只，从眼眶取血处死并且正常解剖取心脏和肝脏，由农业部谷物及制品质量监督检验测试中心按GB/T 5009.93-2003方法（原子荧光分光光度计）检验测定血、肝脏和心脏中的硒水平。

1.2.3 心肌酶的测定：在第22周，从低硒组和对照组各选5只BALB/c鼠眼球取血，分离血清，使用日立7600型生化自动分析仪来测定天冬氨酸氨基转移酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、肌酸激酶MB型同工酶（CK-MB）、α-羟丁酸脱氢酶（HBDH）等心肌酶的水平，数据用student’s t test分析组间差异性。

1.2.4 心肌组织的结构观察：第20周，将低硒组和对照组的小鼠断颈处死，取心脏组织，一部分常规制片观察心肌的病理变化，另一部分戊二醛固定，超薄切片，透射电镜观察心肌组织的超微结构变化。

2 结果

2.1 饲料中硒水平的测定

配制的饲料经农业部谷物及制品质量监督检验测试中心按GB/T 5009.93-2003方法检验，结果含硒量0.016mg/kg（即0.016ppm），符合低硒实验研究要求。

2.2 实验小鼠一般状况观察

2.2.1 行为和状态：低硒饲料喂养16周后，每日观察BALB/c鼠行为活动和生长发育的情况。低硒组小鼠表现活动度明显增强，对外界刺激敏感，毛色不顺。与对照组的BALB/c鼠相比发育减缓，体重增长速度明显降低。生育能力主要观察小鼠的繁殖次数，在四个月的饲养过程中，繁育低硒组没有繁殖，而繁育对照组繁殖4次。

2.2.2 体重：从第16周开始每周对低硒组和对照组的BALB/c鼠称重一次，根据称重的结果绘制BALB/c鼠的生长曲线图。结果可以看出，低硒组BALB/c鼠的体重增长呈停滞状态，并且出现了负增长，而对照组呈正常增长的趋势，两组小鼠体重变化显著（P＜0.05）（图1）。

图1 低硒鼠的体重曲线Fig.1 The body weight changes of mice fed with seleniumdeficient diet

2.3 动物硒水平的测定

对照组鼠肝脏、心脏与血液中的硒水平分别为0.763mg/kg、0.274mg/kg、0.316mg/kg。低硒组的鼠肝脏、心脏和血液中的硒含量则为0.219mg/kg、0.187mg/kg、0.241mg/kg。低硒饲养的动物肝脏、心脏和血液中的硒水平都达到了低硒的标准，其中心脏中的硒水平达到了硒缺乏的程度。低硒饲养后肝脏硒水平下降幅度巨大。

2.4 心肌酶测定结果

在第22周从5只低硒组和5只对照组的BALB/c鼠眼球取血，分离血清，检测天冬氨酸氨基转移酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、肌酸激酶MB型同工酶（CK-MB）、α-羟丁酸脱氢酶（HBDH）心肌酶的水平。结果可以看出，低硒组AST、LDH、CK、HBDH等酶均较对照组高，但是CKMB与对照组持平，具体原因有待进一步研究证实，说明在低硒条件下，心肌酶的变化不明显（图2）（P＞0.05）。

2.5 心肌组织结构观察（图3，4见彩插8）

光镜下观察低硒鼠与正常鼠心肌组织的变化（图3）。对照组小鼠心肌组织可见局灶性心肌细胞变性、溶解，少量炎细胞浸润，心肌纤维排列整齐，呈短圆柱状，心肌纤维之间有薄层结缔组织，胞核呈圆形或梭形，位于细胞中央；低硒组小鼠心肌组织也可见局灶性心肌细胞变性和炎细胞浸润，病变多呈灶状分布，偶见片状，心肌间质充血、水肿，心肌细胞空泡变，心肌纤维间疏松化，肌纤维走形呈波浪状。透射电镜观察低硒组与对照组心肌组织的超微结构变化（图4）。对照组心肌组织可见，心肌细胞膜结构完好，细胞核核型轻度不整，肌节各带结构清晰，线粒体丰富、膜结构清晰，肌浆网轻度扩张，闰盘桥粒和缝隙连接及中间连接结构均好，间质毛细血管内皮细胞完整，腔适中；低硒组心肌组织显示，肌节结构清晰，但是各带结构不完整，部分肌丝溶解形成条索状或管泡状，闰盘连接结构断裂或融合，细胞核出现明显异型性，移位于质膜下，核周线粒体数量明显增多，线粒体嵴呈絮状变，线粒体间可见大量溶酶体出现，肌浆网弥漫性扩张。

图2 低硒鼠与正常鼠心肌酶测定结果Fig.2 Myocardial enzymatic examinations of mice fed with selenium-deficient diet

3 讨论

本研究通过建立硒缺乏小鼠模型，进而研究低硒对心肌的影响。我们根据美国Harlan Teklad公司的TD 92163产品配方，利用产于黑龙江的Torula酵母，加混合维生素、甲硫氨酸（DL-methionine）、玉米油及混合无机盐，配制了低硒饲料，经农业部谷物及制品质量监督检验测试中心按GB/T 5009.93-2003方法检验，结果含硒量0.016mg/kg，符合低硒饲料标准要求。

经低硒饲料饲养18周的BALB/c鼠，取肝脏、心脏和血清检测硒含量，结果为0.219mg/kg、0.187mg/kg、0.241mg/kg，均达到了低硒诊断标准，其中心脏的硒水平达到了硒缺乏的程度。

低硒饲养过程中，Balb/c小鼠的生长发育受到了明显的影响，动物毛发混乱，体重增长减缓，对外界刺激敏感。

在动物机体中存在与正常繁殖力有关的硒蛋白是精子被膜硒蛋白［8.9］，是构成精子细胞囊以及精子尾部中段的主要成份，对其结构功能起重要作用，在低硒的条件下会造成动物繁殖力低下。本研究中，繁育低硒组小鼠在4个月饲养期间没有繁殖，而繁育对照组小鼠繁殖4次，推测与此有关［10.11］。

线粒体是细胞的能量代谢场所，线粒体的改变会导致心肌组织能量代谢障碍。本研究的超微结构观察可见，在低硒条件下心肌组织中发生了一些结构变化，特别是线粒体出现病理变化，线粒体嵴呈絮状改变。此结果与克山病的病理特点相符。但是在光镜下观察，未见到明显的病理改变。说明在低硒的条件下，虽然超微结构发生了变化，但是不会出现明显的病理改变。

我们还检测了低硒饲养小鼠血清中的心肌相关的酶水平，结果AST、LDH、CK、HBDH等酶均较常硒养鼠高，CK-MB与常硒鼠持平，但与常硒鼠比较，这些变化没有显著差异。提示短期的低硒饲养已经造成了小鼠的轻度心肌损伤。

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