单俐敏,张春雷,陈 宏＊,2,房兴堂

(1.徐州师范大学细胞与分子生物学研究所,江苏徐州 221116;2.西北农林科技大学动物科技学院,陕西省农业分子生物学重点实验室,陕西杨凌 712100)

味觉是哺乳动物极为重要的感觉,可以感知五种味觉,甜、酸、苦、咸和鲜。味觉的感受部位即味觉细胞,也叫味觉感受细胞(taste receptor cell,TRC),多位于味蕾中央,细胞的游离端呈毛状突起即微绒毛,微绒毛上存在多种受体。已经发现咸味和酸味的受体是离子通道耦联受体,其他味觉的受体被认为是G蛋白耦联受体(G-protein-coupled receptors,GPCR)。1999年,Hoon.M.A等从多只小鼠的舌头上提取了一些味觉细胞,在对其进行cDNA文库的测序时发现了T1R1基因,选择性地在味觉细胞中表达。以T1R1基因为基础的PCR,又鉴定出T1R2基因[1],接着T1R3基因也在人的DNA文库中被鉴定出来。这三个受体属于GPCR家族C亚型,即T1Rs家族,其中T1R2+T1R3以异二聚体形式共表达并参与甜味识别,而T1R1+T1R3以异二聚体形式共表达并参与鲜味(氨基酸味)识别。目前关于这个受体家族的研究都集中在小鼠和人上,对牛的T1Rs受体家族的研究还没有。牛的味觉是很发达的,口腔内味觉细胞多达1.5万个,比人类有更敏感的味觉感受系统,良好的味觉能够促进牛的食欲,提高采食量,促进生长发育,所以有必要对这个受体家族做进一步的探索。近十几年来由于基因组计划、蛋白质组计划的研究进展迅速,分子生物学、生物信息学、行为学、电生理学等方法的充分利用,对该受体家族的分子机制已取得突破性的进展。本文从甜味和鲜味两个方面对这一受体家族及信号转导机制的最新研究情况做简要综述。

1 哺乳动物T1Rs受体家族

T1Rs家族属于G蛋白耦联受体(GPCR)超家族C亚型成员,这个家族还包括 mGluRs、GABABRs、钙敏受体、V2R受体等。T1Rs是一类独具特色的GPCR,它们拥有大的细胞外结构域,其中包括捕蝇夹域(venusflytrapdomain,VFT),半胱氨酸富集域(cysteine-rich domain,CRD)和七次螺旋跨膜域(heptahelical transmembrane domain,HD)。VFT主要负责配体的识别与结合,它与细菌中的外周质氨基酸结合蛋白PBP(perplasmic amino acid binding proteins PBP)具有一定的序列相似性[2]。HD有相应的3个细胞内环和3个细胞外环。细胞内环和它们相应的跨膜区段高度保守,是G蛋白的结合位点,而各成员的细胞外环差异很大,是配体结合区。

T1Rs基因家族由T1R1、T1R2和T1R33个基因组成。T1Rs受体以异源二聚体的形式发挥作用:T1R2和T1R3结合形成甜味受体(仅表达T1R3受体的细胞也存在,以同型二聚体的形式,但它只是低亲和力的糖受体[3,4]);T1R1和T1R3结合形成鲜味受体。

2 甜味识别依赖的异二聚体膜受体(T1R2+T1R3)

T1R2+T1R3这两种受体共同形成感受各种糖和人工甜味剂的功能受体。T1R2或T1R3基因单剔除的小鼠对各种人工甜味剂的反应消失,对低浓度糖液的反应强烈降低,但对较高浓度的糖液的反应则是部分降低。然而T1R2+T1R3的基因双剔除的小鼠对所有测试的不同浓度的糖液的行为学与电生理学反应均会消失。这些实验证据表明T1R2和T1R3形成了针对人工甜味剂的功能性受体与高亲和力的糖受体,而仅表达其中一种受体的则是作为一种低亲和力的糖受体[5]。

人类能感觉到甜味的甜味剂被许多哺乳动物所喜好,但不同的物种对甜味剂的识别不尽相同,如小鼠喜欢糖精、乙酰磺酸胺钾、三氯蔗糖和甘素[6],但却感觉不到几种人工甜味剂(例如:环已氨磺酸盐、阿力甜、阿斯巴甜)[7,8]。大鼠的甜味受体对三氯蔗糖反应强烈[9],但大鼠不太喜欢三氯蔗糖和甘素[10,11]。猪不能识别一些人工甜味剂(如索马甜、环已氨磺酸盐、新橙皮苷二氢查耳酮(NHDC)、阿斯巴甜等)。

几个实验室利用人类和小鼠对一些人工的或天然的甜味剂的敏感性不同设计了一系列的实验,利用人鼠嵌合体受体去定位 T1R2+T1R3异二聚体的功能域与一些甜味剂反应的关系。这些实验大部分利用异源细胞,揭示出人的T1R2的胞外区是阿斯巴甜和纽甜(neotame)所需[12],人的 T1R3的CRD区是植物甜蛋白(brazzein)所需[13]。人 T1R3的HD区是环已氨磺酸盐所需[12,14],同时也是NHDC作用位点[15]。利用相似的方法揭示,拉克替醇(甜味抑制剂)是人类 T1R3的HD区所需[12,16],这个抑制剂就像高浓度的糖精和乙酰磺酸胺酸钾一样是人T1R2+T1R3的反激动剂。转基因表达人T1R2的人化小鼠对阿斯巴甜,莫内林和其它甜味剂[4]有反应(但对NHDC没有反应)。将人的T1R3基因转到nontaster鼠体内,发现对甜味剂的反应提高了[17],说明T1R3基因与小鼠的sac基因是等同的。猫对任何甜味剂都不喜欢[18],是因为猫的T1R2基因是个假基因,这为 T1R2+T1R3共同起作用提供了支持[19]。

目前T1Rs受体的晶体结构还没有得到,所以配体如何结合并激活受体还不能准确确定,但可以用同源建模的方法从其它已经得到的受体的晶体结构来预测。存在和缺乏配体基的mGluR1 VFT的晶体结构已经得到,T1Rs和mGluRs之间重要的保守结构表明,mGluRs的VFT的晶体是T1Rs同源建模的合理模板[20]。研究发现当T1R2的VFT的两个位点(在mGluRs同系物中是谷氨酸结合的关键位点)发生突变,对二肽甜味剂的反应就会丧失,但只能部分影响蔗糖[12],说明这两类小分子甜味剂都结合在 T1R2的VFD区,但结合的区域不同。GPCR视网膜紫质A亚型的晶体结构也已经得到,它是T1Rs HD建模的合理模板[15]。T1R3的 HD区的大范围诱变揭示HD区的第三五六环是环已氨磺酸盐,NHDC,和拉克替醇的结合位点[12,16]。

人和鼠甜味受体的功能学研究表明,拉克替醇能抑制人的T1R2+T1R3异二聚体的活性,但对鼠没有反应[9],所以Winnig利用定点诱变的方法去研究拉克替醇为什么对鼠的甜味受体不起作用,发现是T1R3跨膜第五区的738Val和735Lys造成的(人是738Ala,735Phe),并推测是因为氨基酸的改变引起蛋白质的结构发生改变,导致拉克替醇很难结合到它的作用位点上[16]。Alexey等人在对T1R3的多态性与人对蔗糖的敏感性之间关系的研究中发现两个C/T的SNPs,T1R3编码区的上游区域与人的蔗糖敏感性非常相关,利用荧光酶报告分析,这两个SNPs的结果表明T与C相比,降低了启动子的活性,影响基因转录,启动子的末端区域潜伏着复合的顺式作用原件,它对启动子有强沉默作用,得出结论,这两个SNPs是通过改变调节元件的功能,影响基因转录。

人类和其它哺乳类动物对甜味剂的喜好不同,利用这些差异已经做了很多实验,也得到了很多信息。但对糖这种哺乳动物都喜欢的甜味剂却无法检测。Nie等利用一种光谱学的方法研究了纯化的T1R2和T1R3VFD区与配体的关系。发现两个亚基与三种糖(葡萄糖、蔗糖、三氯蔗糖)都能结合,但亲和力不同。

某些甜味剂如糖精钠和乙酰磺酸胺钾会产生甜味后觉反应,在低浓度时糖精钠和乙酰磺胺酸钾结合到一个高亲和力的结合点上,产生甜味;而在高浓度时,它们会结合到第二个低亲和力的抑制点上,产生苦味。当甜味抑制成分被水洗掉时,甜味受体重新激活,甜味的感觉又回来了。甜味味觉受体并不局限于味觉上皮,T1R2和T1R3也在胃肠道的营养感知细胞中,起到对营养的识别、同化吸收的作用。小鼠β细胞中也存在的一种蛋白质和构成舌头的甜味受体的蛋白质的碱基序列完全一样。

3 鲜味识别依赖的异二聚体膜受体(T1R1+T1R3)

鲜味(氨基酸味)是五种基本味觉之一,主要指谷氨酸钠(味精)的味道,在1908年被Ikeda.K首次发现,但在最近才被大众接受作为一种基本味觉。研究发现许多物质具有这种味道,如组成蛋白质的20种天然氨基酸,嘌呤核苷酸(如肌苷酸(IMP)、鸟苷酸(GMP))。

不同的物种在味觉感觉上有选择性和特异性。鼠T1R1+T1R3对20种L-型氨基酸都有反应,但人T1R1+T1R3只选择性地对谷氨酸钠(MSG)和天冬氨酸有反应。

T1R1+T1R3能感受天然的20种L-型氨基酸(T1R1+T1R3能识别 L-氨基酸,但不能识别甜-D-氨基酸,如 D-Trp),只有在感知谷氨酸时IMP才对其具有加强作用,这是鲜味的主要特点-协同作用。鲜味受体和甜味受体共享一个共同的T1R3,但能识别不同的味质,说明 T1R1和 T1R2的N-末端胞外域决定了鲜甜受体的配体特异性。利用甜-鲜嵌合体,诱变分析和分子建模方法揭示谷氨酸和IMP协同激活鲜味受体。T1R1的N-末端胞外域是IMP和GMP起加强作用的结合部位,L-Glu配体结合到铰链区(VFD区中的一小段),5'核苷酸结合到捕蝇域开口的位点,进一步稳定闭合现象,通过延长L-Glu留在受体嘴部的时间从而增强鲜味味觉。

环已胺基磺酸盐与人的T1R3的TMD区起作用,对鲜味和甜味受体有不同的作用,它是甜味受体的激活剂,是鲜味受体的增强剂。最近,一种关于GPCRs的C亚型激活的亚基重排机制被提出,所以Zhang.F等提出环已胺磺酸盐诱引T1R3的 TMD的信号改变,导致两个TMD的亚基重排,可能是这两种受体的能量障碍不同,所以这种重排只能激活T1R2+T1R3。

4 甜味和鲜味的信号转导机制

为,人和灵长类动物的味觉传入通路中,孤束核的神经元是第二级神经元,由孤束核的神经元发出的纤维到丘脑腹后内侧核;啮齿类动物的味觉传入通路,由孤束核投射到脑桥的臂旁核,由臂旁核中继后分两条径路投射到丘脑的腹后内侧核、下丘脑外侧区、经其中继后投射到皮质的中央后回最下部的味觉中枢进行味觉感知。

由于甜味化合物化学构成不同,导致甜味信息的转导有着不同的途径。甜味在味觉细胞内的传导途径:蔗糖与特定的GPCR结合后,结合GTP的α亚基与腺苷酸环化酶(AC)结合,使之活化,并将ATP转化为cAMP,导致胞内cAMP浓度升高,进一步激活蛋白激酶A(PKA)磷酸化,然后抑制基底外侧的K+通道,引起胞外Ca2+内流。人工甜味剂与另外一种GPCR结合,激活 PLCβ2,使 PIP2水解成IP3和DG,胞内IP3增加,导致胞内细胞膜上IP3门控Ca2+通道开放,胞内贮存的Ca2+释放。

味蛋白是一种味觉特异性G-蛋白,专门表达于舌味蕾细胞而不表达于其他细胞,它是苦味传导中一种重要的蛋白质。味蛋白由α-gustducin,Gβ3和Gγ 13共3个亚基组成,α-gustducin基因敲除小鼠的行为测试,味觉神经信号记录显示α-gustducin参与某些苦味、甜味和鲜味的转导。味蛋白调节的味觉转导通路:味质与甜/鲜受体结合,激活α-gustducin-Gβ3-Gγ13三聚体,β和 γ亚基释放出来激活磷脂酶 C(PLCβ2)产生三磷酸肌醇(IP3),从而引起胞内贮存的Ca2+释放。上述三种途径释放的Ca2+会激活TRPM5通道,TRPM5使细胞膜去极化导致ATP释放,释放的ATP能激活味觉传入神经细胞上的离子型嘌呤能受体。这个模型被相关信号分子敲除实验支持。

5 小结

味觉受体和味质(tastant)结合后,会导致味觉细胞的细胞膜去极化和神经递质的释放。通过这种方式,味觉受体细胞将感受到的化学信号转化为电信号。然后沿着舌咽神经、面神经的鼓索神经侧支和迷走神经将信号传导至延髓孤束核。多数文献认

目前对于T1Rs受体家族的研究还有很多不足,T1Rs受体晶体还没得到,它是系统研究甜/鲜味剂如何结合并激活其受体的最大障碍。目前的发现仅仅确认了T1Rs受体家族对甜和鲜味群的识别作用,其转导机制还有赖于更先进、更精确、更敏感的研究方法进一步揭示。味觉传导的未来发展方向将集中研究味觉信息在中枢神经系统中是如何进行的。随着对味觉理解的加深,不仅可以通过不同物质的组合产生新的可口的味道,提高我们的生活质量,而且可以让有味觉障碍的人也能品尝到食物的美味。牛的味觉是很发达的,有比人类更敏感的味觉感受系统,但目前对该受体家族的研究主要集中在小鼠和人上,在牛上这方面的研究非常少。良好的味觉能够促进牛的食欲,提高采食量,促进生长发育,所以应该加强牛在这个方面的研究。

[1] Hoon MA,Adler E,Lindemeier J,et al.Putative mammalian taste receptors:a class of taste-specific GPCRs with distinct topographic selectivity[J].Cell,1999,(96):541-551.

[2] Hara P J,Sheppard P O,Thogersen H,et al.The ligand-binding domain in metabotropic glutamate receptors is related to baeterial periplasmic binding proteins[J].Neuron,1993,11(l):41-52.

[3] Nelson G,Chandrashekar J,Hoon MA,et al.An amino-acid taste receptor[J].Nature,2002,(416):199-202.

[4] Zhao GQ,Zhang Y,Hoon M A,et al.The receptors for mammalian sweet and umami taste[J].Cell,2003,(115):255-266.

[5] 张根华,邓少平.味觉受体第一家族与味觉识别[J].生命的科学,2005,25(3):179-181.

[6] Bachmanov A A,Tordoff M G,BeauchampG K.Sweetener preference of C57BL/6ByJ and 129P3/J mice[J].Chem Senses,2001,(26):905-913.

[7] Hellekant G,Danilova V.Species differences toward sweeteners[J].Food Chem,1996,(56):323.

[8] Nowlis GH,Frank M E,Pfaffmann C.Specificity of acquired aversions to taste qualities in hamsters and rats[J].J Comp Physiol Psychol,1980,94:932-942.

[9] Li X,Staszewski L,Xu H,et al.Human receptors for sweet and umami taste[J].PNAS,2002,(99):4692-4696.

[10] Bello N T,Hajnal A.Male rats show an indifferenceavoidance response for increasing concentrations of the artificial sweetener sucralose[J].Nutr Res,2005,(25):693-699.

[11] Fisher G L,Pfaffmann C,Brown E.Dulcin and saccharin taste in squirrel monkeys,rats,and men[J].Science,1965,(150):506.

[12] Xu H,Staszewski L,Tang H,et al.Different functional roles of T1R subunits in the heteromeric taste receptors[J].PNAS,2004,(101):14258-14263.

[13] Jiang P,Ji Q,Liu Z,et al.The cysteine-rich region of T1R3 determines responses to intensely sweet proteins[J].J Biol Chem,2004,(279):45068-45075.

[14] Jiang P,Cui M,Zhao B,et al.Identification of the cyclamate interaction site within the transmembrane domain of the human sweet taste receptor subunit T1R3[J].J Biol Chem,2005,(280):34296-34305.

[15] Winnig M,Bufe B,Kratochwil N A,et al.The binding site for neohesperidin dihydrochalcone at the human sweet taste receptor[J].BMC Struct Biol,2007,(7):66.

[16] Winnig M,Bufe B,Meyerhof W.Valine 738 and lysine 735 in the fifth transmembrane domain of rTas1r3 mediate insensitivity towards lactisole of the rat sweet taste receptor[J].BMC Neurosci,2005,(6):22.

[17] Nelson G,Hoon M A,Chandrashekar J,et al.Mammalian sweet taste receptors[J].Cell,2001,(106):381-390.

[18] Pfaffmann C.Gustatory nerve impulses in rat,cat and rabbit[J].J Neurophysiol,1955,(18):429-440.

[19] Li X,Li W,Wang H,et al.Pseudogenization of a sweet-receptor gene accounts for cats'indifference toward sugar[J].PLoS Genet,2005,(1):27-35.

[20] Kunishima N,Shimada Y,Tsuji Y,et al.Structural basis of glutamate recognition by a dimeric metabotropic glutamate receptor[J].Nature,2000,407:971-977.