丁耀忠,刘永生,陈浩泰,刘文倩,张 杰

重组PrP102-242在COS-1中的表达及表达产物的检测＊

丁耀忠,刘永生,陈浩泰,刘文倩,张 杰

目的 重组的PrP102-242在COS-1细胞中的稳定表达以及表达产物的检测。方法重组表达载体pCI-PrP102-242转染COS-1细胞后,经不同浓度的 G418筛选后获得稳定的细胞系,然后用间接免疫荧光、间接 EL ISA和Western blo t检测目的蛋白的表达。结果间接免疫荧光、间接EL ISA和Western blot检测到目的蛋白在COS-1细胞中的表达。结论目的蛋白PrP102-242在COS-1细胞中的成功表达为下一步研究PrPc的结构和功能奠定了基础。

朊蛋白;COS-1细胞;间接免疫荧光检测技术

牛海绵状脑病(BSE)是成年牛的一种亚急性、进行性、致死性神经系统疾病,是海绵状脑病的一种,其致病因子为 PrPSc〔1〕。PrPSc对 PK具有抗性,能被PK降解为分子量约为27～30kD的片段,即PrP27-30,是PrPSc具有感染性的核心片段。有人认为,体外大量表达的重组PrP27-30基因可以在动物体内最终发展成为PrPsc〔2-3〕。Legname等人用PMCA(protein misfolding cyclic amp lification)扩增重组的含淀粉样纤维的PrP89-230接种转基因小鼠后发现朊病症状〔4〕。

PrP102-242是利用PCR技术从秦川黄牛脑组织中扩增获得的,构建于pMD-18-T载体上,含有牛PrP27-30全部序列。COS-1细胞具有准确的翻译后折叠及修饰功能,表达的糖基化药物蛋白在理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白质分子,能使任何复制启始位置带有SV 40的转染质粒以较高的拷贝数进行复制,而且真核表达重组载体在COS-1细胞内的表达已经相当成熟〔5-7〕。目前未见PrP102-242在COS-1细胞表达系统的报道,本研究旨在使 PrP102-242在COS-1细胞中进行表达,以期为PrPC的结构和功能研究以及免疫学诊断奠定物质基础。

1 材 料

1.1 菌株、载体和细胞株 感受态大肠埃希菌 E.coli DH 5a购自 Takara公司,C0S-1细胞购于上海细胞生物所,pCI-neo载体由本实验室保存。

1.2 主要试剂和工具酶 限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶均购自Fermentas公司;琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、普通DNA产物纯化试剂盒均购自Axygen公司,RNeasy M ini kitRNA提取试剂盒购于 Q IANGEN公司;Lipofectam ineTM 2000购自 Invitrogen公司,DMDM培养基为 Hyclon产品,透析胎牛血清为PAA公司产品,G418 Sulfate购Calbiochem公司,PrP(7B6/D2)小鼠多抗 IgG、HRP标记的 IgG及 FITC标记的山羊抗小鼠的 IgG均购自 Sigma公司,PureY-iedTMPlasmid M idip rep System质粒提取试剂盒由Promega公司提供。其余化学药品为国产分析纯。1.3 PCR引物设计 参照 GenBank已发表的PrP基因序列,设计两对引物,上游:5′-ccggaattcgccgccatgggcaaggtggtaccca-3′,加入 Eco RⅠ酶切位点和Kozak 序列 ,下游 :5′-acgcgtcgacctatgctatgcccctcgttggtaataa-3′,加入 SalⅠ酶切位点,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

2 方 法

2.1 表达载体的构建

2.1.1 从 T载体上进行扩增 PrP102-242基因反应条件为:95℃5 min→(94℃1 m in→58℃50 s→72℃50 s)×35循环→72℃10 min。目的基因经琼脂糖凝胶电泳鉴定正确后用琼脂凝胶DNA快速纯化回收试剂盒回收后备用。

2.1.2 真核表达重组子的构建和鉴定 重组载体构建方法同丁耀忠等人报道的方法〔8〕,命名为PCIneo-PrP102-242;对经 PCR和酶切鉴定为阳性的重组质粒进行序列测定,并用DNA star软件进行序列分析。

2.2 细胞转染及阳性细胞克隆的筛选

2.2.1 脂质体转染、PCR及 RT-PCR检测转染情况 脂质体转染、PCR及RT-PCR检测同丁耀忠等人报道的方法〔8〕。

2.2.2 阳性细胞克隆的筛选 细胞转染后48 h,用含100μg/m L的 G418的DM EM培养基进行阳性克隆的筛选,至对照组(未转染的COS-1细胞)全部死亡,转染组中剩余的细胞即为阳性细胞,待其长满单层后用胰酶消化后转至新的6孔板中,培养基中 G418浓度提高至200μg/m L、300μg/m L和400 μg/mL继续筛选后进行后续检测。

2.3 表达蛋白的检测

2.3.1 间接免疫荧光检测目的蛋白的表达和免疫活性 间接免疫荧光检测同丁耀忠等人报道的方法〔8〕。

2.3.2 间接EL ISA检测细胞中蛋白的表达 筛选中获得的目的单克隆细胞为30D1,空载体为5C2为检测对照,并设置阳性、阴性和空白对照,待检测的单克隆细胞经细胞裂解处理后进行倍比稀释检测,一抗为PrP(7B6/D2)小鼠 IgG,二抗为 HRP标记的山羊抗小鼠IgG:

(1)反复冻融的细胞4 000r/min离心去除细胞碎片,p H 9.3的包被缓冲液稀释细胞液,每孔50μL,4℃包被过夜后用 PBST洗涤缓冲液洗涤3次,每次5m in,弃液甩干。

(2)每孔加入50μL封闭液,37℃放置1h,同上洗涤。

(3)加1∶300稀释的 PrP(7B6/D2)小鼠 IgG,37 ℃1 h,同上洗涤。

(4)每孔加入用PBST1∶3 000稀释的 HRP-山羊抗小鼠IgG,37℃1 h,同上洗涤。

(5)每孔加入50μL显色液,37℃避光20 min。

(6)每孔加入50μL反应终止液终止反应。用酶标仪测定OD490值。

2.3.3 Western blot检测 Western blot参照《精编分子生物学实验指南》方法进行,一抗为 PrP(7B6/D2)小鼠 IgG,二抗为山羊抗小鼠 IgG,以30D1为检测目标,以5C2为对照。

3 结 果

3.1 重组表达载体构建

3.1.1 PCR结果鉴定 PCR产物用0.8%琼脂糖电泳,结果显示扩增出大小约420bp的片段,与预期片段大小相同,见图1。

3.1.2 PrP基因的克隆和真核表达载体的构建经宝生物测序的 PCR产物,登录 GenBank进行基因序列同源性分析(登录号:EU 553893.1)同源性为98%。重组载体 pCIneo-PrP102-242经 SalⅠ和Eco RⅠ双酶切后,形成大小分别为 420bp和5400bp 2个片段,与预期结果相符,见图2,表明重组真核表达载体pCIneo-PrP102-242构建成功,重组载体构建示意图见图3。

图1 PrP102-242PCR产物Fig.1 PCR analysis of PrP102-242 M:2 000 DNA ladder;1:PrP102-242

图2 表达载体pCIneo-PrP102-242双酶切鉴定Fig.2 The digestion of recombinant plasm id of pCIneo-PrP102-242.M 1:10 000 DNA Ladder;1:pCIneo-PrP102-242;2:SalⅠ+Eco RⅠdigestion of pCIneo-PrP102-242;M 2:2 000bp DNA Ladder

3.2 细胞转染及阳性细胞克隆的筛选

3.2.1 RT-PCR检测转染 转染后48h,取部分细胞提取其RNA,用1.3引物进行PCR扩增,结果扩增出了大小为420bp的片段,与预期结果一致,而空载体对照组和空白对照组均未扩增出条带,表明pCIneo-PrP102-242重组质粒转染成功,具有转录活性。

3.2.2 阳性细胞克隆的筛选 利用 G418加压筛选约20d获得6～10个正常生长的抗性细胞群。待抗性细胞长满6孔板后,用胰酶消化转入新的6孔板,用含有150μg/mL G418的DM EM进行筛选继续筛选15 d,随后每4～5 d依次用200μg/m L、300 μg/m L和400μg/m L G418的培养基筛选,2～3 d细胞即可长满培养板板底,表明已筛选出稳定转染的COS-7细胞。当 G418浓度为500μg/mL的培养基时,筛选细胞很快死亡,后续实验采用400μg/m L的G418用于抗性筛选细胞。筛选出 PrP102-242基因转染单克隆细胞为30D1和pCI-neo转染的单克隆细胞命名为5C2。

图3 重组载体pCIneo-PrP-27-30构建Fig.3 Construction of recombinant plasm id pCIneo-PrP102-242

3.3 检测结果

3.3.1 间接免疫荧光检测 重组质粒pCIneo-PrP102-242转染COS-1细胞后利用间接免疫荧光技术进行检测,在细胞中观察到特异性的亮绿色荧光,证明蛋白得到表达,见图4。

3.3.2 间接EL ISA检测细胞中蛋白 检测一抗、二抗的工作浓度分别为1∶300和1∶4 000,检测结果见表1。检测结果表明,表达了重组蛋白的30D1的EL ISA反应值较高,1∶4稀释的细胞裂解液OD值达到1.326。

3.3.3 Western blo t检测结果 Western blot检测时,一抗工作浓度为1∶200,二抗为1∶2 000。检测结果见图5、图6,稳定转染的30D1单克隆化细胞检测到PrP102-242在18 kD处有特异的反应条带,而对照的空质粒转染5C2细胞则没有相应的条带,证明所构建的在 COS-1内表达的重组PrP102-242具有反应原性。

表1 间接EL ISA检测细胞中的目的蛋白Table 1 The expression of pCIneo-PrP102-242 by in-EL ISA

4 讨 论

利用间接免疫荧光、间接 EL ISA和 Wetern blo t技术检测表明 PrP102-242转染COS-1细胞具有反应原性,间接 EL ISA检测结果表明30D1的EL ISA值较高,但是不同的筛选阶段还是有较大差别。说明用G418筛选的不同的阳性细胞株之间的表达量差异较大。SDS-PAGE和 Western-blot分析表明30D1表达分子量分别为18.0kD,Westernblot结果表明30D1能与PrP单抗(7B6/D2)发生特异性反应。

PrP102-242蛋白能在COS-1细胞中稳定表达,但是蛋白表达量并没有达到理想的水平〔9-10〕,原因可能是试验中随机整合到宿主细胞的基因组,利用G418加压进行扩增时,周边序列的扩增可能对细胞的正常生长产生不良影响等,从而导致不能获得高表达细胞系。另外,我们所选择的 PrP102-242,不含有氨基端的信号肽和羧基端添加 GPI锚的信号肽,它可能也影响蛋白表达。

图6 Western blot鉴定Fig.6 western blot analysis of pCIneo-PrP102-242 M:Protein molecular weight marker;1:5C2 is pCIneo;2:30D1is pCIneo-PrP102-242

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Detection and expression of recombinan t protein PrP102-242 in COS-1 cells

D ING Yao-zhong,L IU Yong-sheng,CHEN Hao-tai,L IU Wen-qian,ZHANG Jie

(Lanzhou Veterinary Research Institute,Chinese Academ y of A gricultural Sciences,State Key Laboratory of Veterinary Etiological B iology,Key Laboratory of Veterinary Public Health of M inistry of A gricu lture,Key L aboratory of Animal Virology of Ministry of Agriculture,Lanzhou 730046,China)

To detect the expression of product of recombinant protein PrP102-242 in COS-1 cells,purified recombinant protein of PrP102-242 were transfected into COS-1 cells,to obtain stable cell lines using different concentration of G418.After that,the expression of recombinant protein PrP102-242 in COS-1 were detected by using indirect immunity fluorescence assay(in-IFA),indirect enzyme linked imm unoso rbent assay(in-EL ISA)and Western blo t assay.The result showed that expression of pCIp264 in COS-1 were detected by using in-EL ISA,IFA and Western blot.

prion protein(PrP);COS-1;indirect immunofluo rescence

Q786

A

1002-2694(2010)12-1097-04

＊国家自然科学基金(No.30671563)资助

张杰,Email:scarlettezhang@yahoo.com

中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,农业部畜禽病毒学重点开放实验室,农业部兽医公共卫生重点开放实验室,兰州 730046

2010-07-25;

2010-09-10