黄现青,高晓平,赵改名,史 超,李苗云,柳艳霞,张秋会,孙灵霞

(河南农业大学食品科技学院,河南郑州 450002)

大肠埃希菌(Escherichia coli)广泛分布于自然界,主要寄居于人及动物的肠道,是一种条件性致病菌。在食品卫生中,大肠埃希菌作为指示菌,根据食品中大肠埃希菌的有无来间接地判定食品被粪便污染的可能程度[1]。大肠埃希菌是人和许多动物肠道中最主要且数量最多的一种细菌。它侵入人体一些部位时,可引起感染,如腹膜炎、胆囊炎、膀胱炎及腹泻等。人在感染大肠埃希菌后的症状为胃痛、呕吐、腹泻和发热。感染可能是致命性的,尤其是对孩子及老人[2]。大肠埃希菌对食品的污染严重危害着人们的食品安全与健康。在对食品安全愈加重视的当今社会,由于化学防腐剂的安全性受到挑战,天然食品防腐剂备受青睐。开发广谱、高效、安全的天然食品防腐剂,具有重要的现实意义。乳酸链球菌素(Nisin)、ε-聚赖氨酸和壳聚糖在食品防腐方面具有很好的杀菌效果,能够有效抑制细菌的生长繁殖,延长食品保质期,是更加安全可靠的新一代食品防腐剂[3-5]。本实验的研究有望通过应用生物防腐剂对大肠埃希菌进行控制和杀灭,减少其对人体的危害以及在食品中的存活数量,提高人们的食品安全水平,保障人们的饮食健康。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 大肠埃希菌(Escherichia colis)AS1.487株,购于中国科学院微生物所;

1.1.2 培养基 ①LB液体培养基(%)：牛肉膏0.5,蛋白胨1,NaCl 0.5,pH 7.2;②LB固体培养基(%)：牛肉膏0.5,蛋白胨1,NaCl 0.5,琼脂1.5,pH 7.2。

1.1.3 防腐剂 Nisin、ε-聚赖氨酸、壳聚糖,分别购自洛阳市华健生物工程有限公司、浙江银象生物有限公司、山东潍坊海之源生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌种活化与培养 将大肠埃希菌菌种接种于LB试管斜面培养基上,37℃培养24 h,将菌种活化。菌种经活化后,接入LB液体培养基,37℃、150 r/min振荡培养。

1.2.2 最小抑菌浓度测定 取经16～18 h增菌培养的大肠埃希菌菌液100μL和1 mL LB液体培养基于试管中,加入防腐剂倍比稀释,共稀释12次,于37℃、150 r/min培养18～20 h后观察并经比色测定大肠埃希菌的生长情况,以大肠埃希菌不生长的稀释度为最小抑菌浓度(M I C)。

1.2.3 杀菌动力学 将经过培养的大肠埃希菌菌液于1 500 r/min离心10 min,弃上清液,用50 mL无菌水收集菌液。取制备的大肠埃希菌细胞悬液分装于12个试管中,每个试管5 mL菌液,向其中一组加5 mL无菌水作为空白,取其他3组试管加入抑菌剂5 mL,使试管中抑菌剂浓度为1 M IC,置于4℃冰箱中放置。空白在0 h取样倒平板,其余的分别在3、6、9 h取样倒平板,将平皿置于37℃恒温培养箱中培养,24 h后取出,菌落计数。

1.2.4 灭活优化实验 将培养16～18 h的大肠埃希菌菌液100 mL于1 500 r/min离心10 min,弃上清液,用100 mL蒸馏水收集菌液,将菌液分装于9组试管,每个试管0.5 mL,然后按正交表设计添加防腐剂用量,使其最终浓度为正交表中各水平浓度,最后用无菌水补足10 mL,同时设空白对照组,见表1。将试管于4℃冰箱中放置24 h后,每支试管取出0.1 mL,稀释6个梯度,倒平板计数。

表1 正交试验因素与水平L9(33)Table 1 Orthogonal factors and the level

1.2.5 应用试验 取50 mL大肠埃希菌菌液于1 500 r/min离心10 min,弃上清液,用50 mL无菌水收集菌液。取2组试管,一组加3种抑菌剂的最佳配比(由正交实验得出),再加0.5 mL菌液,用美汁源果粒橙补足10 mL。另一组只加0.5 mL菌液,用牛奶补足10 mL。将试管放入冰箱中48 h,然后倒平板并计数,计算杀菌率[6]。

2 结果与分析

2.1 最小抑菌浓度

用液体倍比稀释法测定M IC,测定结果显示,壳聚糖、ε-聚赖氨酸、Nisin的M I C分别为10、2.5、0.078 mg/mL。

2.2 杀菌动力学

通过平板计数法测定壳聚糖、ε-聚赖氨酸、Nisin对大肠埃希菌的杀菌动力学,结果见图1。由图1可以看出,壳聚糖组对菌落总数没有影响;Nisin组效果比较明显,菌落对数曲线明显下降,3 h后下降趋于平缓;ε-聚赖氨酸组的菌落对数曲线下降明显,3 h后效果减弱。结果表明,Nisin和ε-聚赖氨酸对大肠埃希菌的杀灭效果较明显,而壳聚糖对大肠埃希菌几乎没有杀灭作用。

2.3 灭活优化实验(正交法)

按L9(33)正交表设计添加防腐剂用量,优化杀灭大肠埃希菌效果,结果见表2。由表2可知,Nisin的极差最大,对大肠埃希菌的抑制效果起主要影响作用,最佳处理组合：Nisin、ε-聚赖氨酸、壳聚糖的浓度分别为0.04、0.01、5 mg/mL。

图1 Nisin、ε-聚赖氨酸和壳聚糖的抑菌效果Fig.1 Inhibitory effect ofNisin、ε-poly-L-lysine and chitosan

表2 正交试验结果Table 2 Orthogonal test results

2.4 应用实验

由于在不同的介质中可能会影响防腐剂的抑菌效果,以果粒橙为介质研究了复合Nisin、ε-聚赖氨酸、壳聚糖应用效果实验,显示其杀菌率可达88.57%,3种抑菌剂的最佳组合对大肠埃希菌有明显的杀灭作用。

3 结 论

研究结果表明,壳聚糖、Nisin、ε-聚赖氨酸的最小抑菌浓度分别为10、2.5、0.078 mg/mL。当壳聚糖、Nisin、ε-聚赖氨酸的浓度分别为5、0.04、0.01 mg/mL时对大肠埃希菌的抑制作用最好,在这一最佳组合条件下对鲜乳介质中的大肠埃希菌杀菌率达88.57%。

[1] 徐晓可,吴清平,周艳红,等.肉类中大肠埃希菌O157：H7多重PCR检测方法的建立[J].微生物学通报,2008,35(4)：619-622

[2] 何国庆,贾英民.食品微生物学[M].北京：中国农业大学出版社,2002：384-387.

[3] 蒋士龙.几种化学防腐剂的安全性及鉴别方法[J].肉类工业,2007,(11)：38-39.

[4] Belewu,M.A.,Belewu,K.Y.Nk wunonwo,C.C.Effect of biological and chemical preservatives on the shelf life of West African soft cheese[J].African Journal of Biotechnology,2005,4(10)：1076-1079.

[5] 高兆银,李敏,胡美姣,等.壳聚糖涂膜对香蕉保鲜生理和防腐效果初步研究[J].浙江农业科学,2007,3：278-280.

[6] Magnusson M,Svensson,B.Svensson.Bacillus cereus Spores During Housing of Dairy Cows：Factors Affecting Contamination of Raw Milk[J].Journal of Dairy Science,2007,90(6)：2745-2754.