孙慧洁,黄惠琴,朱 军,孙前光,余中华,鲍时翔＊

(1.中国热带农业科学院热带生物技术研究所,海南海口 571101;2.海南大学环境与植物保护学院,海南儋州 570228)

海绵属于动物界多孔动物门,大多数栖息于海洋中,是营固生活的一类多细胞后生动物,体壁上有许多小孔或管道与外界或中央腔相通,依靠过滤海水中的微生物为食。全世界约有10 000～15 000种海绵[1],是海洋中除珊瑚外的第二大生物量,是迄今为止海洋天然产物的最大来源。我国南海海域辽阔,造礁珊瑚极其发达,很适合海绵的生长和繁殖,因此,南海海绵的种类远比中国其他海域丰富。由于海绵属于底栖滤捕食动物,其独特的摄食、滤食系统使其体内蕴藏了丰富的微生物。据估计,海绵体内和体表的微生物群落占海绵干重的40%左右,最高可达70%,比周围海水微生物含量高出2～4个数量级[2]。分子生物学研究也表明海绵中存在大量的微生物资源,然而已成功分离的微生物物种却仅占整个海绵微生物群落的0.1%[3]。为寻找新的微生物资源,本文利用R2A培养基对采自海南三亚的海绵样品进行细菌选择性分离,并对其中2株细菌进行鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 海绵样品 2008年7月于三亚市小东海采集到3种新鲜海绵,放入无菌采样袋,2 h内送回实验室处理,不能及时送回实验室的则放于冰盒内低温短时间保存。

1.1.2 培养基 ①R2A培养基：酵母膏0.5 g,蛋白胨0.5 g,酸水解酪素0.5 g,葡萄糖0.5 g,可溶性淀粉0.5 g,磷酸氢二钾0.3 g,无水硫酸镁0.024 g,丙酮酸钠0.3 g,琼脂18 g,陈海水750 mL,蒸馏水250 mL,pH 7.4;②LB培养基：蛋白胨10 g,牛肉膏3 g,陈海水750 mL,蒸馏水250 mL,pH 7.2～7.4。1.1.3 主要试剂 蛋白酶K(Merck Co.Ltd.)、PCR试剂盒(上海生工生物工程技术有限公司)、琼脂糖(Promega Co.Ltd.),其他常用试剂均为国产分析级试剂。

1.2 方法

1.2.1 样品的处理 将采集的海绵样品用无菌海水洗涤2～3次后,用无菌的手术刀将样品切成小块,然后在无菌研钵中研磨5 min,使成为均匀浆状。一部分作为本实验材料立即处理,另一部分以1：1的比例加入40%甘油水溶液放置-80℃保存备用。

1.2.2 海绵细菌的分离培养 将样品进行系列稀释,选择10-3、10-4稀释度涂布于R2A培养基平板,各5个重复,置于25℃培养箱中倒置培养。分别在培养3、7、12、15、19、36 d观察平板上菌落生长情况,挑取单菌落纯化。将分离到的菌株在R2A培养基与LB培养基平板上划线培养,选择在营养丰富的LB培养基上生长势较弱的菌株作为本实验的目标菌。

1.2.3 细菌基因组DNA提取 参照文献[4]。

1.2.4 16S r DNA的PCR扩增[5]根据细菌16S r DNA保守序列,合成引物：27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)。PCR反应体系(50μL)：5μL 10×PCR buffer,5μL 2 mmol/L dNTP,3μL 25 mmol/L MgCl2,1μL 20μmol/L引物27F,1μL 20μmol/L引物1492R,0.4μL Taq Polymerase(5 U/μL),1μL模板DNA和33.6μL无菌水。PCR扩增条件：94℃预变性2 min,94℃变性30 s,52℃退火1 min,72℃延伸2 min,35个循环,72℃延伸10 min。采用1%的琼脂糖凝胶对PCR产物电泳检测。

1.2.5 16S rDNA序列同源性分析 16S rDNA扩增产物经PCR产物纯化试剂盒纯化,由上海生工生物工程有限公司进行测序。将序列结果与

GenBank中核酸数据进行Blast比对,选取同源性高的菌株序列用于系统发育学分析。使用Clustal X1.8和MEGA2软件进行多序列匹配排列,用Neighbor-Joining法构建系统发育树。

1.2.6 形态观察 接种于R2A培养基平板,25℃倒置培养7 d,观察菌落形状、大小和形态。同时挑取菌体,进行革兰染色,用光学显微镜观察[6]。

1.2.7 生理生化实验 参照文献[6]中有关方法进行生理生化特征鉴定。

2 结果与分析

2.1 海绵细菌的分离培养

从海绵样品中分离到89株菌落形态有差异的细菌,将分离到的菌株接种到R2A培养基与LB培养基平板上,与在R2A培养基上的长势相比,有13株菌在LB培养基上生长较缓慢、长势也较弱,选择这些在营养丰富的LB培养基上长势较弱的菌株作为本实验的目标菌。

2.2 16S rDNA序列结果分析

对获得的13株菌进行基因组DNA提取,16S r DNA的PCR扩增。产物经测序后进行系统发育分析,其中菌株HB09009与B acillus carboniphilus JCM9731T(AB021182)同源性最高,为97.1%,发育树上处于同一个分支,亲缘关系较近。菌株HB09012的Blast结果中,同源性较高的多为未培养菌,有效菌株中与Planctom yces marisDS M8797T(NR025327)同源性最高,为97.4%,二者在发育树上也处于同一个分支。2株菌在GenBank中的登录号分别是GU263833和GU263834。系统发育树见图1、图2。

图1 基于16S rDNA的HB09009与相关菌株的系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree based on the 16S rRNA gene sequences of strain HB09009 and representatives

图2 基于16S rDNA的HB09012与相关菌株的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree based on the 16S rRNA gene sequences of strain HB09012 and representatives

2.3 形态特征

菌株HB09009菌落圆形、较小,白色,湿润、略透明,边缘规则。革兰染色为阳性,不具运动性;菌株HB09012菌落圆形、较小,浅黄色,较干燥、不透明,中央略隆起,边缘整齐。革兰染色为阳性,具有运动性。

2.4 生理生化特征

菌株HB09009生长温度为20～39℃,适盐范围为2%～5%,生长pH 4.0～7.5。接触酶、甲基红、硝酸盐还原呈阳性,氧化酶、V-P测定、纤维素分解、明胶液化、淀粉水解和脂酶呈阴性。可利用甘露醇、葡萄糖、D-棉子糖、纤维二糖、L-精氨酸、L-脯氨酸、淀粉、果糖、甘氨酸等碳源,不利用的碳源有肌醇、山梨醇、D-木糖、D-半乳糖、蔗糖、α-乳糖、L-胱氨酸、氨基乙酸、L-半胱氨酸、麦芽糖、L-酪氨酸、4-氨基丁酸。与系统发育树上同源性最高的B acillus carboniphilus在生长条件、培养特征和生理生化等方面存在明显差异,见表1。

表1 菌株HB09009与Bacillus carboniphilus的比较Table 1 Comparison between strain HB09009 and Bacillus carboniphilus

菌株HB09012生长温度为20～39℃,适盐范围为2%～10%,生长pH 4.0～8.0。接触酶、硝酸盐还原呈阳性,氧化酶、甲基红、V-P测定、纤维素分解、明胶液化、淀粉水解和脂酶呈阴性。可利用肌醇、山梨醇、甘露醇、D-木糖、葡萄糖、α-乳糖、L-精氨酸、L-脯氨酸、L-酪氨酸、淀粉、果糖、甘氨酸等碳源,不利用的碳源有D-半乳糖、D-棉子糖、蔗糖、纤维二糖、L-胱氨酸、氨基乙酸、L-半胱氨酸、麦芽糖、4-氨基丁酸。(G+C)mol%含量为49.4%。与系统发育树上同源性最高的Planctom yces m aris在生长条件、培养特征和生理生化特性等方面差异明显,见表2。

表2 菌株HB09012与Planctom yces m aris的比较Table 2 Comparison between strain HB09012 andPlanctomyces maris

2.5 鉴定结果

菌株HB09009具有芽胞杆菌属的典型特征,但与系统发育树上同源性最高的B acillus carboniphilus相比,二者在生长条件、培养特征和生理生化等方面存在较大的差异,因此很可能是B acillus属的一个新种,暂定为B acillussp.HB09009。菌株HB09012具有浮霉菌属的典型特征,与系统发育树上同源性最高的Planctom yces m aris相比,二者在生长条件、培养特征和生理生化特性等方面也存在较大的差异,很可能是Planctom yces属的一个新种,暂定为Planctom ycessp.HB09012。

3 讨 论

海洋是典型的寡营养环境,生活在其中的细菌选择了对环境资源高亲和性的生长策略,适应低营养含量。此类菌个体微小,生长缓慢,生长速率和丰度变化很小[9]。在寡营养浓度下,它们依然可以吸收足够的有机质来维持生长,营养的增加甚至会阻碍其生长[10]。R2A培养基虽然营养浓度低,但种类丰富,尤其是含有丙酮酸钠成分,具有毒性氧降解的能力[11],对一些在常规培养基分离被忽略的类群具有一定的分离效果,本研究获得的13株菌是常规培养基分离所忽略的类群。实验还发现,在R2A培养基上,虽然菌落形成速度慢,但会陆续稳定形成。因此培养寡营养环境中的细菌,可适当延长培养时间,使其长至肉眼可见的尺度[12]。

细菌分类和鉴定经历了长期不断的发展和提高。早期的分类系统主要以形态特征、培养特征及生理生化特征等表观分类学特征,对其进行描述分类。但是传统分类不能确切说明遗传进化地位和关系。随着科学技术的进步,核酸序列分析等分子生物学技术在现代分类学中已占主导地位。一般认为,16S rDNA序列同源性≥95%的菌可归为同一属,≥97%可视为同一种。因此,在进行菌株鉴定时,16S rDNA序列同源性低于95%的菌可考虑建立新属,低于97%的可建立新种,≥97%时必须测定DNA-DNA杂交率才能确定是否为新种。本文从海绵中分离的2株菌HB09009、HB09012 16S rDNA序列同源性分别是97.1%、97.4%,因此需要测定DNA-DNA杂交率来确定是否为新种。

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