薛 清,段春梅,王玲娜,林雁冰＊

(1.西北农林科技大学植物保护学院,陕西杨凌 712100;2.西北农林科技大学资源环境学院,陕西杨凌 712100 3.西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌 712100;)

放线菌是一类产生丰富生物活性物质的重要微生物资源。放线菌是新的生物活性物质的主要产生菌,放线菌资源研究对抗生素工业发展有重要影响。今天随着放线菌生物多样性研究的进展,放线菌仍然具有产生新的生物活性物质的极大潜力[1]。研究资料显示,目前已分离出的放线菌仅占其自然界存在总量的10%～20%,大多数放线菌由于多种原因不能在人工培养基上生长。要分离到更多的新放线菌类群,需要探索新的分离方法。目前,国内外在放线菌分离方法研究方面已经取得了较大的进展[2-8],研究发现,采用多种物理、化学刺激以及改变培养基成分等措施[9-12],能有效提高稀有放线菌的出菌率,并分离出放线菌的新种属[13-15]。微波是一种振荡频率为每秒24.5亿次高频电磁波。微波的加热与杀菌作用已有大量研究,微波对生物体可以产生热效应、电效应、磁效应及化学效应等,从而引起生物细胞多种生理生化变化或致死效应[16]。从物理学和生物学原理推知,低强度微波辐射有可能消除抑制放线菌孢子萌发的某些制约因素,使部分不可培养放线菌的孢子萌发,增加可培养放线菌的种类与数量。杨斌等[17]研究了微波处理不同有机质含量沙质土壤引起的放线菌数量变化,发现微波处理可以显著增加放线菌的出菌率和拮抗性放线菌比例,但对钙质土壤及培养基加钙后微波的处理效应尚不清楚。本文重点探索中强度微波预处理对钙质土壤和培养基加CaCl2后土壤放线菌数量的影响,旨在为改善放线菌分离效果的微波预处理技术研究提供新的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 土壤样品 供试土壤为栗钙土,碳酸钙含量为29.7～40.7 g/kg,采自内蒙古自治区太仆寺旗宝昌镇永胜村西芹田。其中,1～3号土样为风干土样,4号土样为4℃冰箱保存的湿土样。土壤pH用DELTA 320pH计测定,有机质用重铬酸钾氧化-外加热法测定,碳酸钙用盐酸气量法测定[18]。土壤化学性质见表1。

表1 供试土壤化学性质Table 1 The chemical properties of the soil tested

1.1.2 培养基 放线菌分离培养基：高氏1号培养基(GA)[19];高氏1号加钙培养基(GA-Ca),即高氏1号培养基加入5 g/L的CaCl2;腐植酸琼脂培养基HA[20]。以上培养基均在灭菌后加入灭菌的浓度为8 g/L的K2Cr2O7至80μg/mL。

1.2 方法

1.2.1 试验方案 试验设2个处理：对照土样(CK)：不进行微波辐照;微波处理(Microwave Irradiation,M I)：120W功率模式下微波辐照3 min。1.2.2 土壤预处理 1～3号土样在自然状态下风干;4号土样为湿土,4℃冰箱保藏。试验前将1～3号风干称5.0 g碾磨至细粉的土样,加95 mL无菌水制成悬液;4号湿土样直接称5.0 g加95 mL无菌水制成悬液,同时测定土壤含水量,用于计算干土含菌量。微波处理：称取磨细的1～3号干土和4号湿土各5.0 g置于10 mL塑料离心管中,加入3 mL无菌水湿润(使土壤能够吸收微波);离心管放置于装有500 mL、24℃自来水的水浴中(避免待处理土壤样品因温度升高产生温度效应),将放置土壤样品的水浴置于微波炉内,以功率120 W模式处理3 min,再用灭菌针管吸取无菌水冲洗土样,转入装有92 mL无菌水的三角瓶中,震荡15 min分离测数。

1.2.3 放线菌分离计数及初步鉴定 将处理好的土壤悬液用10倍稀释法稀释,充分混匀后分别吸取0.1 mL滴加于GA、GA-Ca及HA平板上,重复3次。涂布均匀后在28℃下倒置培养10 d,计数,并据菌落形态特征将具有链霉菌和小单孢菌菌落特征的放线菌暂定为“链霉菌属”和“小单孢菌属”,其余放线菌皆归入“未鉴定属”。同时挑取放线菌单菌落于高氏1号斜面中培养保存。

1.2.4 数据处理与结果计算 微波处理土壤放线菌数量与对照的相对差异用微波效应EM I表示,计算公式如下：

式中Nm、Nck及EM I分别为微波处理、对照CK的放线菌数量及微波效应。

试验结果显著性分析采用DPS 9.50数据处理系统(T-检验)。

2 结果与分析

2.1 微波对放线菌数量的影响

2.1.1 GA培养基 从表2可以看出,就GA培养基而言,微波处理能够提高放线菌出菌率。其中,供试土样放线菌总数较对照增加99.5%～234.1%,均达到极显著水平(P＜0.01);链霉菌较对照增加58.3%～377.7%,除3号土样外均达到极显著水平;对小单孢菌而言,1～3号干土增加94.7%～651.4%,其中2、3号土样微波处理与对照的差异达到显著水平(P＜0.05),4号湿土较对照减少4.4%,与对照差异不显著;未鉴定属放线菌较对照增加96.7%～304.8%,均达到显著(P＜0.05)或极显著水平(P＜0.01)。

表2 微波处理后高氏1号培养基上放线菌的分离数量(105cfu/g)Table 2 The quantity of actinomycetes isolated from the medium of GA aftermicrowave irradiation(105cfu/g)

2.1.2 GA-Ca培养基 微波处理后GA-Ca培养基上放线菌出菌率也有不同程度增加,见表3。其中放线菌总数较对照增加8.8%～180.6%,均达到极显著(P＜0.01)或显著水平(P＜0.05);链霉菌总数较对照增加17.7%～151.3%,其中2号和3号土样达到极显著水平(P＜0.01);小单孢菌增加2.3%～420.0%,其中2号和3号土样达到显著水平(P＜0.05);未鉴定属增加8.8%～234.5%,除4号土外,其余土壤样品均达显著(P＜0.05)或极显著水平(P＜0.01)。

表3 微波处理后GA-Ca培养基上的放线菌数量(105cfu/g)Table 3 The quantity of actinomycetes isolated from the medium of GA-Ca aftermicrowave irradiation(105cfu/g)

2.1.3 HA培养基 HA培养基为链霉菌的选择性培养基。微波处理后,HA培养基上链霉菌分离数量增加显著,见表4。4种土样较对照增长79.0%～126.0%,均达到极显著水平(P＜0.01)。说明微波处理能够显著增加HA培养基上链霉菌的数量。

表4 微波处理后腐植酸培养基上链霉菌分离数量(105cfu/g)Table 4 The quantity ofStreptomycetesisolated from the medium of HA aftermicrowave irradiation(105cfu/g)

由以上分析可看出,采用低强度微波对土壤进行预处理可以增加放线菌的出菌率,大多数土样的处理效应达到显著或极显著水平,在3种培养基上的结果表现出基本相同的趋势。

2.2 不同培养基上的微波效应

从图1可以看出,在不同培养基上EM I不同,其变化呈现出基本相同的趋势：对放线菌总数、未鉴定属放线菌及2号和3号土样的小单孢菌数量而言,EM I均表现为GA＞GA-Ca;对链霉菌数量表现为GA＞HA＞GA-Ca。微波处理后,GA培养基上放线菌总数的EM I最大,GA上4个土样处理后的EM I分别较GA-Ca培养基上处理后提高77.1%、120.9%、26.4%及90.7%;GA培养基上1、2、4号土壤链霉菌数量的EM I分别较HA培养基上链霉菌数量的EM I提高173.6%、139.8%、75.3%,即培养基成分影响微波效应。

2.3 土样含水量对微波效应的影响

从图1中1～3号干土与4号湿土(含水量415 g/kg)的微波增率对比可以看出,微波处理后湿土中放线菌总数、未鉴定放线菌数量的EM I均小于1～3号干土,其中4号土GA上放线菌总数的EM I较1～3号土样分别减少134.6%、201.9%、65.9%;在GA-Ca培养基上放线菌总数的EM I分别减少148.16%、171.7%、130.2%;除3号土的在GA培养基上的测值外,1～3号土壤在GA、GA-Ca培养基上链霉菌数量的EM I也符合湿土小于干土的趋势;在HA培养基上,1、2、3号土壤链霉菌数量的EM I分别减少65.2%、158.9%、47.0%,即冰箱4℃保藏的含水量较高的新鲜土样的EM I应低于风干土壤,其原因尚不清楚。

图1 供试土壤不同培养基上微波处理后放线菌数的微波效应Fig.1 The EM Iof the quantity of the actinomycetes on the differentmedia in the tested soil aftermicrowave irradiation

3 讨 论

为了分离到更多的新放线菌种类,很多学者不断对放线菌分离方法进行探索,研究工作主要集中在样品预处理、抑制剂选择以及改变培养基成分等方面。样品预处理包括物理方法处理与化学方法处理。化学方法主要是通过添加适当浓度的某种化学抑制剂,抑制链霉菌的生长,或者加入孢子激活剂,促进孢子萌发,从而选择性地分离出稀有放线菌。如姜怡等[9]向土壤悬液加入6%的酵母膏和0.05%的十二烷基磺酸钠混合液,在40℃处理20 min,能有效地分离到小单孢菌属、链孢囊菌属、马杜拉菌属及小双孢菌属等稀有放线菌。物理方法主要有干热预处理[21]、超声波振荡、土壤悬液差速离心法以及极高频辐射法等[9]。Li等[10]使用1 kHz以上的极高频射线(EHF)对土壤悬液进行照射,发现在波长8～11.5 mm时,各稀有放线菌总数较对照提高了7.5倍。Li等[11]使用连续照射与极高频辐射结合的方法,发现在波长为4.6～5.8 mm及8～11.5 mm时,放线菌总数与稀有放线菌的种类及数量大幅度提高。Likhacheva等[12]用超高频辐射法(SHF)对几种链霉菌孢子悬液进行不同时间的预处理,发现不同处理时间链霉菌的生物量以及活性均受到不同程度的影响。微波是一种高频电磁波,利用微波杀菌已有大量研究及应用。但用微波处理改善放线菌分离效果研究很少,国外仅有Bulina等[2]将其应用于放线菌分离的初步研究报道,该研究发现,小功率、短时间微波处理对放线菌分离效果有一定影响,使用80 W微波对土壤悬液处理30 s时能有效提高小单孢菌属、小多孢菌属、诺卡氏菌属及马杜拉菌属等稀有放线菌的比率。杨斌等[17]研究了微波处理时间对不同有机质含量沙质土壤放线菌分离效果的影响,发现微波处理后高有机质土壤放线菌总数、链霉菌数以及小单孢菌数较对照有一定程度的增加,120 W中等强度、3 min条件下处理效果最好。本试验研究了该条件下微波处理钙质土壤对放线菌分离效果的影响,发现微波处理后绝大部分供试钙质土壤在GA、GA-Ca及HA 3种培养基上的放线菌总数、链霉菌数、小单孢菌及未鉴定放线菌数量均有明显增加,与杨斌等微波处理不同有机质含量沙质土壤时得到的结果[17]一致,表明微波处理土壤对放线菌分离时出菌量的提高效果具有较为广泛的一致性。

另外,本研究探讨了微波处理对钙质土壤放线菌在不同培养基上分离效果的影响,发现加钙培养基(GA-Ca)上的微波效应(EM I)小于高氏1号培养基(GA),该结果说明加钙也能提高放线菌的出菌率。鉴于在现有分离方法和条件下,土壤中可培养放线菌的数量是一定的,如果加钙激活一部分孢子,剩余的待微波激活的孢子量就会减少,导致在加钙培养基GA-Ca上的EM I小于高氏1号,该推论尚待进一步证实。

在本研究中,将待处理土壤样品置于装水量500 mL、24℃的水浴中,消除了微波处理期间加热引起样品温度升高产生的热效应,故本研究中微波处理对放线菌出菌率的影响主要来自微波高频电磁波的生物效应。初步推断,微波对放线菌出菌率的增加可能与放线菌孢子的通透性改变有关。短时间微波处理湿土可能改变细胞膜的通透性,影响水分和养分进入孢子,促进部分难萌发孢子萌发,增加出菌量,本研究中风干土样的微波处理效应大于湿土样的结果也支持微波处理影响孢子膜透性的推断。但上述推论及微波增加放线菌出菌量的详细机理尚待进一步研究证实。

[1] 刘志恒.放线菌—微生物药物的重要资源[J].微生物学通报,2005,32(6)：143-145.

[2] Bulina T I,Alferova IV,Terekhova L P.A novel approach to isolation of actinomycetes involving irradiation of soil samples with microwaves[J].Microbiology,1997,66(2)：231-234.

[3] Hayakawa M,Sadakata T,Kajiura T,et al.New methods for the highly selective isolation of micromonospora and microbispora from soil[J].Journal of Fer mentation and Bioengineering,1991,72(5)：320-326.

[4] Hayakawa M,Kajiura T,Nonomura H.New methods for the highly selective isolation of streptosporangium and dactylosporangium from soil[J].Journal of Fermentation and Bioengineering,1991,72(5)：327-333.

[5] Hayakawa M,Tamura T,Nonomura H.Selective isolation of actinoplanes and dactylosporangium from soil by usingγ-collidine as the chemoattractant[J].Journal of Fermentation and Bioengineering,1991,72(6)：426-432.

[6] HayakawaM,Tamura T,Iino H,et al.Pollen-baiting and drying method for the highly selective isolation of actinoplanes spp.from soil[J].Journal of Fermentation and Bioengineering,1991,72(6)：433-438.

[7] HayakawaM,Momose Y,Kajiura T,et al.A selective isolation method for Actinomadura viridis in soil[J].Journalof Fermentation and Bioengineering,1995,79(3)：287-289.

[8] Hendricks CW,Pascoe N.Soilmicrobial biomass estimates using 2450MHz microwave irradiation[J].Plant and Soil,1988,110(1)：39-47.

[9] 姜怡,段淑蓉,唐蜀昆,等.稀有放线菌分离方法[J].微生物学通报,2006,33(1)：181-183.

[10] Li YV,Terekhova L P,GapochkaM G.Isolation of actinomycetes from soil using extremely high frequency radiation[J].Microbiology,2002,71(1)：105-108.

[11] Li YV,Terekhova L P,Alferova IV,et al.The application of succession analysis in combination with EHF irradiation to the selective isolation of actinomycetes from soil[J].Microbiology,2003,72(1)：114-117.

[12] Likhacheva A A,Komarova A S,Luk yanov A A,et al.The Influence of SHF radiation on soil streptomycetes[J].Eurasian Soil Science,2006,39(8)：854-858.

[13] 肖炜,李铭刚,崔晓龙,等.几种选择性分离稀有放线菌的方法[J].微生物学通报,2006,33(1)：133-137.

[14] 杨宇容,徐丽华,段若玲,等.稀有放线菌分离方法的研究[J].云南大学学报(自然科学版),1997,19(4)：403-408.

[15] 张学武,张建丽.稀有放线菌的选择性分离[J].生命科学仪器,2005,3(6)：17-20.

[16] 吴道澄,金友煌,席晓莉,等.高功率微波对金黄葡萄球菌杀灭效应的实验研究[J].中国医学物理学杂志,1999,16(3)：183-186.

[17] 杨斌,薛泉宏,陈占全,等.微波处理对土壤放线菌分离效果的影响[J].应用生态学报,2008,19(5)：1091-1098.

[18] 鲍士旦.土壤农化分析[M].北京：中国农业出版社,2000.

[19] 程丽娟,薛泉宏.微生物学实验技术[M].西安：世界图书出版公司,2000.

[20] 林超峰,陈占全,薛泉宏,等.青海三江源地区风沙土养分及微生物区系[J].应用生态学报,2007,18(1)：101-106.

[21] 司美茹,薛泉宏,来航线.放线菌分离培养基筛选及杂菌抑制方法研究[J].微生物学通报,2004,31(2)：61-65.