黄玖利,戴好富,王 辉,郁 蕾,梅文莉

(中国热带农业科学院热带生物技术研究所农业部热带作物生物技术重点开放实验室,海南海口 571101)

海南粗榧(Cephalotaxus hainanensisLi)为三尖杉科(Cephalotaxaceae)三尖杉属(Cephalotaxus)植物[1]。该植物因含有已被开发成治疗白血病的临床药物高三尖杉酯碱和三尖杉酯碱而倍受关注[2]。但因其生长缓慢,加之过度采伐,目前数量稀少,已被列为国家二级保护植物。近年来,植物内生菌研究的迅速发展不仅使人们认清内生真菌在生态系统中的重要地位,更让人们认识到它是一种重要的药用生物资源。前人已从植物内生真菌中分离得到生物碱、甾体、萜类、醌类和木脂素等多种类型化合物,并多具有抗肿瘤、抗菌、促进宿主植物生长、生物防治等生物活性,在医药业和农业中有巨大的应用潜力。本研究组从海南粗榧韧皮部分离出S15菌株,在生物活性筛选过程中,发现其发酵液提取物对胃癌细胞显示出强细胞毒活性[3]。对该菌株扩大发酵,从其代谢产物中分离得到2个具有细胞毒活性的化合物,通过波谱方法鉴定其结构为去乙酰基细胞松弛素D(Zygosporin D,1)和细胞松弛素D(Cytochalasin D,2)。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 内生真菌 菌种S15分离自海南粗榧韧皮部,暂被归为无孢菌群[4],菌种保藏于中国热带农业科学院热带生物技术研究所。

1.1.2 肿瘤细胞株 MMC-7721(人肝癌细胞)、SGC-7901(人胃癌细胞)和K562(慢性髓原白血病细胞)均购于中科院上海生命科学研究院细胞库。

1.1.3 临床病原菌 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 51650、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)ATCC 9551由中国热带农业科学院热带生物技术研究所洪葵教授提供。

1.1.4 培养基 ①马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)：马铃薯200 g,葡萄糖20 g,定容至1 L,pH自然;②马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：马铃薯200 g,葡萄糖20 g,琼脂20 g,定容至1 L,pH自然;③燕麦培养基：燕麦片30 g,琼脂20 g,定容至1 L,pH自然;④玉米培养基：玉米粉300 g,琼脂20 g,定容至1 L,pH自然;⑤牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(NA)：牛肉膏3 g,蛋白胨10 g,NaCl 5 g,定容至1 L,pH 7.4～7.6;⑥肿瘤细胞株采用RPM I1640完全培养基。

1.1.5 试剂 乙酸乙酯、氯仿、甲醇、丙酮、石油醚,均为分析纯;碘化铋钾、硅胶、GF254薄层层析板和柱层析、200-300目硅胶(青岛海洋化工厂)、Sephadex LH-20(Merck公司)。

1.1.6 仪器 重庆光电BK2301显微镜,Heidolph Laborota-20L旋转蒸发仪,Bruker AV-400核磁共振波谱仪(T MS内标),Autospec-300质谱仪。

1.2 方法

1.2.1 菌株S15形态观察 将斜面保存的菌株S15经PDA培养基活化,用灭菌打孔器(Φ=4.5 mm)取菌龄一致的菌丝块,接种在PDA培养基平板中央,置于25℃恒温箱中培养,培养7 d后,测量并记录直径。将菌丝块接种在PDA、燕麦、玉米培养基上,14 d后观察产孢情况。

1.2.2 提取与分离 将斜面保存的菌株S15经PDA培养基活化后接种于30 L PDB培养基中,25℃静置培养30 d。发酵产物用双层纱布过滤,发酵液经减压浓缩至2 L,用乙酸乙酯萃取3次,萃取液减压浓缩后得乙酸乙酯萃取物9.5 g。乙酸乙酯萃取物经硅胶柱色谱以氯仿-甲醇(体积比20：1和10：1)梯度洗脱得14个流分(Fr.1～Fr.14),Fr.8经Sephadex LH-20柱色谱以氯仿-甲醇(体积比1：1)洗脱得化合物1(830 mg),Fr.9经硅胶柱色谱以石油醚-丙酮(5：1)洗脱后再经Sephadex LH-20柱色谱以氯仿-甲醇(体积比1：1)洗脱得化合物2(26 mg)。

1.2.3 结构鉴定 所分离到的纯化合物用Autospec-300质谱仪测定分子量,用BrukerAV-400核磁共振波谱仪(T MS内标)测定NMR数据。

1.2.4 化合物活性测试 ①抗肿瘤活性测定：以S MMC-7721、SGC-7901和K562细胞为指示瘤株,待测化合物1 mg溶于100μL DMSO,采用MTT[5]法测定体外细胞毒活性。选取对数生长期的细胞,用RPM I1640完全培养基制成单细胞悬浮液,血球计数板计数,按50 000个/mL接种90 μL于96孔平底细胞培养板,K562中直接加样品10μL,S MMC-7721和SGC-7901经培养24 h后,再加入样品10μL;以DMSO为阴性对照,丝裂霉素C为阳性对照,培养条件为5%CO2、湿度90%以上、温度37℃,加入样品后继续培养72 h,完成培养后取出,置于显微镜下观察每孔细胞形态。然后加入5 mg/mL的MTT溶液15μL,37℃反应4 h后,吸弃上清,再向各孔加入100μL DMSO,充分溶解,用ELX-800酶标仪测量各孔的OD值(测量波长为490 nm),按下式计算抑制率,并求出I C50值。

②抗临床病原菌活性测定：采用滤纸片法[6]测定样品抗菌活性。S.aureus和MRSA采用NA培养基培养。将S.aureus和MRSA分别制成一定浓度的菌悬液(105～107cfu/mL),用棉签将其均匀涂布于供试无菌平板,制成含菌平板,待测化合物和阳性对照卡拉霉素浓度均为20μg/μL,待试样品25μL用灭菌滤纸片(Φ=8 mm)吸附后挥干,制成含样滤纸片,每个平板放置4个,每处理重复3次,空白滤纸片为阴性对照,S.aureus和MRSA 37℃恒温培养24 h后观察结果,测量并记录抑菌圈直径。

2 结果与分析

2.1 菌株S15形态观察

S15菌落白色,疏松,表面绒毛状,与培养基结合较紧密,在PDA培养基上25℃生长7 d后平均直径为42.7 mm。菌丝无色,长短、粗细不等,单个或数个相连,菌丝不分枝。壁平直、直径约为3～7μm。部分菌丝较细,直径约为1.5～3.5 μm,弯曲。在PDA、燕麦、玉米培养基上均不产孢。

图1 S15的菌落形态Fig.1 The colony of S15

图2 S15的菌丝形态(400×)Fig.2 The mycelia of S15(400×)

2.2 化合物结构鉴定

2.2.1 化合物1 白色晶体(丙酮),体积分数10%的硫酸显棕黄色。碘化铋钾显色呈橙黄色,推测其为生物碱或含有N原子。EI-MS∶m/z 465[M]+,结合13C NMR(DEPT)谱和1H NMR谱推定其分子式为C28H35NO5。1H NMR谱部分数据见表1,13C NMR谱数据见表2。

表1 化合物1(400 M Hz,Acetone-d6)和2的氢谱数据(400 M Hz,CDCl3)Table 1 1H NMR spectral data for compounds 1(400 MHz,Acetone-d6)and 2(400 MHz,CDCl3)

化合物1的各种波谱数据与文献[7]报道的去乙酰基细胞松弛素D(Zygosporin D)的数据比较基本一致,基于上述分析,鉴定该化合物为去乙酰基细胞松弛素D(Zygosporin D),其结构式见图3。

2.2.2 化合物2 白色晶体(氯仿),体积分数10%的硫酸显棕黄色,碘化铋钾显色呈橙黄色,推测其为生物碱或含有N原子。EI-MS：m/z507[M]+,结合13C NMR(DEPT)谱和1H NMR谱推定其分子式为C30H37NO6。1H NMR谱部分数据见表1,13C NMR谱数据见表2。该化合物各种波谱数据与文献[8]报道的细胞松弛素D的数据比较基本一致,基于上述分析,鉴定该化合物为细胞松弛素D(Cytochalasin D),其结构式见图3。

图3 化合物1和2的结构Fig.3 Structures of compounds 1 and 2

表2 化合物1(100 M Hz,Acetone-d6)和2的碳谱数据(100 M Hz,CDCl3)Table 2 13C NMR spectral data of compounds 1(100 MHz,Acetone-d6)and 2(100 MHz,CDCl3)

2.3 生物活性测试

2.3.1 抗肿瘤活性测试 采用MTT法对2个化合物的抗肿瘤活性进行测试,结果显示2种细胞松弛素对K562、S MMC-7721无细胞毒活性,对SGC-7901有细胞毒活性,其I C50值见表3。

2.3.2 抗临床病原菌活性测定 采用滤纸片法测定了2种化合物抗临床病原菌活性,结果表明2种细胞松弛素对S.aureus和MRSA均无抑菌活性。

表3 化合物1和2的细胞毒活性Table 3 The cytotoxic activities of compounds 1 and 2

3 讨 论

细胞松弛素类化合物是一类由真菌代谢产生的毒素,已从长蠕孢属(Helm inthosporiumsp.)、座坚壳属(Roselliniasp.)、曲霉属(Aspergillus sp.)、基点属(Phom asp.)、拟茎点霉属(Phom opsissp.)、毛壳菌属[9](Chaetom iumsp.)、肉球菌属[8](Englerom ycessp.)、接菌孢属[10](Zygosporiumsp.)、绿僵菌属[11](M etarrhiziumsp.)、鹿角菌属[12](Xylariasp.)、炭团菌属[13](Hypoxylon sp.)、轮层炭壳属[14](Daldiniasp.)、鞘孢属[15](Chalarasp.)和丝核菌属[16](Rhizoctoniasp.)等真菌中分离得到,它们中有一些具有显著的生物学活性,如抑制哺乳动物细胞分裂、抑制H IV-1蛋白酶、抗菌和抗肿瘤等活性。细胞松弛素因为具有改变细胞微结构的作用,因此成为细胞生物学中细胞微结构和功能研究的常用工具,用于探讨细胞分裂、细胞运动和吞噬、细胞核和质的关系和细胞生物合成等生命活动。

细胞松弛素D最早由英国学者Aldridge等于1969年从绿僵菌属(M etarrhiziumsp.)分离得到并鉴定,后又从肉球菌属(Englerom ycessp.)及鹿角菌属(Xylariasp.)分离得到。去乙酰基细胞松弛素D最早由日本学者Minato于1970年从接柄孢属(Zygosporiumsp.)分离得到并鉴定,后又分别从肉球菌属(Englerom ycessp.)及绿僵菌属(M etarrhiziumsp.)分离得到。本研究从海南粗榧内生真菌S15中同时分离得到细胞松弛素D和去乙酰基细胞松弛素D,2种细胞松弛素对人胃癌细胞(SGC-7901)均有强细胞毒活性,其作用机理还有待进一步研究,但2种细胞松弛素对临床病原细菌S.aureus和MRSA的生长均无抑制作用。

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