唐雪生，张先平 李 珩，刘 芳

(长江大学临床医学院，荆州市第一人民医院药学部，湖北 荆州 434000)

HPLC法测定结肠炎定位片中大黄素的含量

唐雪生，张先平 李 珩，刘 芳

(长江大学临床医学院，荆州市第一人民医院药学部，湖北 荆州 434000)

目的：研制结肠炎定位片，并建立HPLC法测定该制剂中大黄素的含量。方法：采用高效液相色谱法，色谱柱：Kromasil-C18柱(250mm×4.6mm,5μm)；流动相：甲醇-0.1%磷酸(88∶12)；流速：1ml/min；检测波长：254nm；柱温：36℃。结果：大黄素进样量在0.064～0.512μg范围内与峰面积呈良好线性关系，回归方程为：Y大黄素=2.504×103X+1.976，r=0.9997(n=5)；平均加样回收率为100.35%，RSD为1.93%(n=5)。结论：HPLC方法简便、准确、重复性好，可用于结肠炎定位片中大黄素的含量测定。

高效液相色谱法；结肠炎定位片；大黄素；含量测定

结肠炎定位片[鄂药制字(2001)第LZ07-003号]系湖北中医药高等专科学校附属中医院研制的一种结肠定位制剂，由金不换、黄连、白术、白芨、丹参等14味药材制成，具有健脾益气、清热利湿、行气止痛、活血化瘀之功效，临床用于各种急慢性结肠炎的治疗。经该院多年临床使用验证，疗效较好。金不换为方中君药，大黄素为其主要有效活性成分之一。为更好地控制该制剂的内在质量，保证其临床疗效，我们参考文献[1～3]采用HPLC法对结肠炎定位片中大黄素的含量进行测定，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1仪器LC-4A高效液相色谱仪，SPD-6A紫外检测仪，C-R4A色谱工作站(日本岛津)；高速离心机(美国MICRO12-24)。

1.2试药大黄素对照品(中国药品生物制品检定所，批号：0756-200110)；结肠炎定位片(自制，规格：0.5g，批号：070307、070308、070309)；甲醇为色谱纯；其他试剂均为分析纯；实验用水使用多效蒸馏水。

2 处方与制备

2.1处方金不换1.5kg、黄连0.8kg、黄芩1.5kg、白术1.5kg、茯苓1.5kg、泽泻2.0kg、山药1.5kg、白芨1.5kg、丹参2.4kg、陈皮1.2kg、木香1.0kg、吴茱萸0.5kg、赤石脂1.5kg、甘草0.6kg、硬脂酸镁0.055kg、交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPXL) 0.372kg、肠溶衣剂0.54kg，共制1 200片。

2.2制备方法陈皮、木香、吴茱萸三味药水蒸汽蒸馏法提取挥发油。药渣与除山药外的其它诸药加水提取两次，水提取液用乙醇沉淀，回收乙醇，浓缩至稠膏。山药干燥粉碎成细粉，与稠膏混合干燥粉碎。加乙醇以12目筛网制粒，干燥、整粒。取以上颗粒，加挥发油、PVPXL、硬脂酸镁混匀压片,包肠溶衣。铝膜罩泡包装，12片/板，装盒即得。

3 方法与结果

3.1色谱条件色谱柱：Kromasil-C18柱(250mm×4.6mm,5μm)；流动相：甲醇-0.1%磷酸(88∶12)；

流速：1ml/min；检测波长：254nm；柱温：36℃。进样量：20μl。

3.2溶液制备

3.2.1对照品溶液的制备 精密称取干燥至恒重的大黄素对照品4mg，置于25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取10ml，置50ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成每1ml含32μg大黄素的对照品溶液。

3.2.2供试品溶液的制备 取结肠炎定位片5片，除去薄膜衣层，研细，取细粉1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，置水浴中加热回流1h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，弃去初滤液。精密量取续滤液15ml，水浴蒸干，残渣加水-盐酸混合(10∶1)溶液20ml溶解，置水浴中加热水解1h，冷却，移于分液漏斗中，用三氯甲烷强力振摇提取4次，每次15ml，合并三氯甲烷液，在水浴上蒸干，残渣用适量甲醇溶解，并定量转移至25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，离心15min，分取上清液，即得供试品溶液。

3.2.3阴性对照溶液的制备 按处方比例和工艺，制成不含金不换的阴性对照品，再按供试品溶液制备方法，制成阴性对照溶液。

3.3系统适用性试验分别取“3.2.1”对照品溶液、“3.2.2”供试品溶液和“3.2.3”阴性对照溶液20μl，照“3.1”项下色谱条件注入色谱仪，记录色谱图，结果见图1。由图1可见，供试品色谱图中，在与对照品色谱相应的位置上，有相同的色谱峰，而阴性对照色谱无相应的色谱峰，表明处方中其它组分对测定无干扰。

A为大黄素对照品；B为供试品；C为阴性对照；1为大黄素色谱峰。图1 高效液相色谱图

3.4标准曲线的制备分别精密吸取“3.2.1”项下大黄素对照品溶液2、4、8、12、16μl，按“3.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱峰面积，并以峰面积(Y)对进样量(X)进行线性回归，得回归方程:Y大黄素=2.504×103X+1.976，r=0.9997(n=5)，表明大黄素进样量在0.064～0.512μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

3.5精密度试验精密吸取“3.2.1”项下大黄素对照品溶液20μl，按“3.1”项下色谱条件，重复进样5次，测得大黄素峰面积，RSD为1.34%(n=5)；再精密吸取“3.2.2”项下供试品溶液20μl，按“3.1”项下色谱条件，重复进样5次，测得大黄素峰面积，RSD为1.35%(n=5)。结果表明，本方法精密度较好。

3.6重复性考察取同一批样品(批号：070309)，共5份，按“3.2.2”项下方法平行制备供试品溶液，分别精密吸取各供试品溶液20μl，按“3.1”项下色谱条件进行测定。结果，RSD为1.37%(n=5)，表明本法重复性较好。

3.7稳定性考察取同一供试品溶液各20μl，分别于配制后0、2、4、6、8、12h测定大黄素峰面积。结果，RSD为1.37%(n=6)，表明供试品溶液在12h内基本稳定。

3.8加样回收率试验精密称取已知含量的同批样品(批号：070307，含量为0.45mg/g)1.0g,共5份，分别精密加入大黄素对照品，按“3.2.2”项下方法处理后，照“3.1”项下色谱条件进行测定，计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果

表2 3批样品中大黄素含量测定结果

3.9结肠炎定位片中大黄素的含量测定取3批不同批号的样品，按“3.2.2”项下方法制备共试品溶液，按“3.1”项下色谱条件进行测定，按外标法计算样品中大黄素的含量。每一批样品测2次，取平均值，结果见表2。

根据3批样品的测定结果，暂定每1g结肠炎定位片中含大黄素不少于0.45mg。

4 讨论

方中金不换为蓼科土大黄(Rumex madaio Makino)[4]，清热解毒、破瘀生新、消肿痛、止血标本兼顾为君药；黄连、黄芩合用清热燥湿止痢，共为臣药；白术、茯苓、山药、泽泻益气健脾渗湿，达到脾旺湿除的作用；丹参祛瘀止痛、活血通经，白芨收敛、生肌止血，佐以陈皮、木香、吴茱芋理气消胀，使气血同调、气血畅行；赤石脂收涩止泻；甘草调和诸药。

经提取试验证明，甲醇为溶剂，水浴加热回流1h，可将结肠炎定位片中大黄素提取完全。

经水解试验证明，加盐酸水浴加热回流水解1h，结合型大黄素可基本水解成游离型大黄素，用三氯甲烷提取4次，每次15ml，基本可提取完全。

在流动相的选择上，我们比较了甲醇-水、甲醇-水-醋酸、甲醇-0.1%磷酸溶液等不同组分和比例的流动相，结果发现以甲醇-0.1%磷酸(88∶12)作为流动相，分离效果最好。由图1可见，在本实验色谱条件下，样品中大黄素与其他组分分离良好，主峰位置与对照品色谱图基本一致，且峰形对称；阴性对照色谱中在与对照品色谱相应位置处无色谱峰，表明处方中其他组分均不干扰大黄素的测定。

采用高效液相色谱法对制剂中的大黄素进行含量测定，方法简便，结果准确，重复性及回收率均理想，可以有效地控制产品的内在质量。

[1]王克英. HPLC测定土大黄中大黄素的含量[J]. 中国中医药信息杂志，2003，10(9)：34-35.

[2]徐选明，季瑛，刘新，等. 大黄中大黄素提取工艺的优化[J]. 中国中医药信息杂志，2004，11(5)：423-424.

[3]王丽，张山川，徐珽，等. 高效液相色谱法测定咽炎颗粒中大黄素的含量[J]. 中国药房，2007，18(9)：684-686.

[4]赵学敏. 本草纲目拾遗[M]. 上海：商务印书馆，1954：256-258.

[编辑] 一 凡

2009-05-28

湖北省教育厅重点自然科学项目(D200662001)；荆州市科技局自然科学项目(200217E07-15)

唐雪生(1974-)，男，广西藤县人，主管药师，从事临床药学工作。

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2009.03.022

R917

A

1673-1409(2009)03-R046-03