郭朝猛， 袁 鹏， 聂梦良

循环肿瘤细胞是乳腺癌患者一种重要不良预后因素，因为早期的肿瘤细胞播散是导致疾病进展的主要原因之一[1-2]，如果能在亚临床阶段检测到微小转移灶，则对临床判断疾病预后和指导治疗有重要意义。近年来，逆转录-聚合酶联(RT-PCR)法检测技术以其高灵敏性被广泛应用于各种实体恶性肿瘤微转移的检测。本研究利用RT-PCR法，以CEA mRN为标志物,检测乳腺癌患者外周血中的循环肿瘤细胞,并初步探讨其临床意义。

1 材料与方法

1.1 临床资料 收集北京大学临床肿瘤学院乳腺癌防治中心收治的46例女性乳腺癌患者外周血标本，以上患者均经病理学证实，年龄27～77岁，中位年龄49.7岁。组织学类型按WHO乳腺肿瘤组织学标准分类：浸润性导管癌43例，单纯癌2例，黏液癌1例。TNM分期按国际抗癌联盟标准：Ⅰ期11例，Ⅱ期17例，Ⅲ期11例，Ⅳ期7例。所有患者取血前均未进行手术、化疗或放疗。收集乳腺纤维瘤患者(17例)及健康志愿者(11例)的血标本作为对照组。

1.2 试剂和引物设计 RNA提取及RT-PCR试剂盒购自Promega公司，DNA Marker购自Sangon公司。CEA mRNA引物及内参照参考文献[3]设计，购自GIBICO公司。CEA mRNA上游引物序列为：5′-GAGCGAACCTCAACCTCTCCTGCCACT-3′，CEA mRNA下游引物序列为：5′-TGTAGCTGTTGCAAATGCTTTAAGGAAGAAGC-3′，扩增目的片段长度为366bp。PBGD上游引物序列为：5′-GAC TGG AGG AGT CTG GAG TC-3′，下游引物序列为：5′-AAT CCC TGG AAG GCT TGA AC-3′，扩增目的片段长度为186bp。

1.3 标本的收集与总RNA的抽提 抽取5 mL外周血，EDTA抗凝，采用淋巴细胞分离液，按密度梯度离心法，提取单个核细胞层(PMNC)。根据Total RNA Isolation System 试剂盒说明提取总RNA。

1.4 RT-PCR扩增 按照Promega公司Access RT-PCR System 试剂盒说明进行。RT-PCR总反应体系为50 μL，其中AMV/Tf1 5×buffer 10 μL，dNTPs 1 μL，上游和下游引物各5 μL， 25mM MgSO42 μL，AMV反转录酶1 μL，Tf1 DNA聚合酶1 μL，RNA样品3 μL，无核酶水22 μL。具体反应条件如下：反转录48℃，45 min；反转录酶变性94℃，2 min。接以35次循环扩增，末次延伸72℃，10 min。

1.5 PCR产物分析 取扩增反应液CEA mRNA与PBGD各7 μL，加上样缓冲液混匀，2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外检测仪下观察并拍照。

1.6 统计学处理 分类变量的检验采用χ2检验及Fisher确切概率法，采用SPSS13.0 统计软件进行数据处理，以P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 CEA mRNA的检测结果 46例乳腺癌患者外周血中有15例CEA mRNA呈阳性，阳性率为32.6%(见图1)。17例乳腺良性疾病患者和11例健康志愿者外周血中CEA mRNA表达均为阴性。乳腺癌组与对照组比较CEA mRNA阳性表达有极显著差异(P<0.01)。

2.2 乳腺癌患者外周血中CEA mRNA的表达与临床病理学特征的关系 由表1可见CEA mRNA的阳性表达与患者的淋巴结转移状况、TNM分期差异有统计学意义，而与患者的年龄、原发肿瘤大小、病理类型以及激素受体状况等差异均无统计学意义(P>0.05)。

图1 CEA mRNA检测结果 M：DNA分子量标志，1～5例为乳腺癌患者外周血中均出现186bp的内参照PBGD阳性条带，其中2、3泳道出现366bp的CEA mRNA 阳性条带。

临床病理参数例数CEAmRNA阳性(n，%)阳性阴性P值年龄(岁)>0．05 ≤49．7258(32．0)17(68．0) >49．7217(33．3)14(66．7)肿瘤大小(cm)>0．05 ≤2101(10．0)9(90．0) >23616(44．4)20(55．6)淋巴结转移<0．05 有2112(57．1)9(42．9) 无253(12．0)22(88．0)TNM分期<0．05 Ⅰ112(18．2)9(81．8) Ⅱ173(17．6)14(72．4) Ⅲ114(36．4)7(63．6) Ⅳ76(83．3)1(16．7)病理类型>0．05 浸润性导管癌4314(32．6)29(67．4) 其他31(33．3)2(66．7)ER>0．05 阴性258(32．0)17(68．0) 阳性217((33．3)14(66．7)PR 阴性288(28．6)20(71．4) 阳性187(38．9)11(61．1)>0．05

3 讨论

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，肿瘤的转移是乳腺癌患者死亡的主要原因，大约有30%的局限性乳腺癌患者最终发生远处转移，这主要由于经血流播种的肿瘤细胞引起[2]。如依靠肿瘤扩散的临床表现或者图像分析技术来诊断肿瘤转移，往往为时已晚。例如常规的影像学方法只能发现直径≥1 cm 的结节(约1 g)，相当于109个肿瘤细胞,这时常常已出现其他系统或器官的转移；而血浆中大分子肿瘤标志物浓度的改变常发生在疾病进展的晚期。RT-PCR方法灵敏性高,可在106～107个WBC中检测到1个癌细胞，且所需样品量少[4-5]，被认为是目前最适于发现肿瘤早期转移的方法。

CEA mRNA属于上皮组织特异性标志基因，在正常人的间叶组织不表达；CEA在绝大多数导管浸润性乳腺癌组织中呈阳性，而在原位癌、小叶癌中的阳性率仅为30%，在乳腺良性疾病中多呈阴性，这为检测外周血中微转移提供了可能[6]。本组46例乳腺癌患者外周血中有15例CEA mRNA阳性，阳性率为32.6%，而对照组中CEA mRNA表达均为阴性，表明CEA mRNA检测乳腺癌外周血循环肿瘤细胞具有较高的特异性。通过分析CEA mRNA的表达与乳腺癌临床病理学特征的关系显示，乳腺癌患者的淋巴结转移状况、TNM分期与CEA mRNA的检出率差异有统计学意义，而在肿瘤大小、病理类型等方面CEA mRNA的检出率差异均无统计学意义。提示一旦在乳腺癌患者的外周血液中检出CEA mRNA表达，表明患者可能已存在肿瘤微转移，且随分期的增加，CEA mRNA表达的阳性率亦增高。

血循环中检测出肿瘤细胞，在一定程度上表明肿瘤具有较强的转移倾向，可帮助解释临床上一些早期无任何转移征象的肿瘤患者在手术完整切除后仍然在短期内出现了转移和复发的现象，这无疑也有助于临床肿瘤的分期、治疗方案的选择和预后的判断。本研究只在术前检测了患者外周血中CEA mRNA的表达情况，关于CEA mRNA的阳性表达与术后复发、转移和预后的关系还有待于对患者进一步的随访、观察。

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