唐金海， 吴建中， 冯继锋， 李苏平， 赵建华

乳腺癌的复发转移是影响患者预后和生存的关键因素，其发生机制目前还不十分清楚。现有的理论和研究倾向于认为原发性肿瘤的侵袭和转移特性以及雌激素受体信号传导通路的活化状态在很大程度上决定了其术后复发转移的可能性[1]。研究乳腺癌细胞的这些表型特征，并通过相关基因及其表达谱的检测，达到准确而有效地预测肿瘤复发转移的目的，以指导临床个体化治疗，是乳腺癌研究急待解决的课题。本研究拟应用快速、简便、准确和高通量的实时定量RT-PCR芯片技术筛选并确定一组与乳腺癌转移相关的特征基因，探讨其表达在疾病发展如术后复发中的预测价值。

1 材料与方法

1.1 临床资料 选择2002年5月至2005年3月期间在江苏省肿瘤医院普外科诊治并行乳腺癌根治术，且保存有完整石蜡包埋组织样本的乳腺癌病例。根据术后5年随访期内患者是否出现复发进行分组，选取复发转移者41例为研究组(包括因复发转移而死亡者7例)，未复发仍存活者40例为对照组。所有病例均有完整的病历和随访资料，两组病例的病理学特征见表1。

表1 研究组和对照组乳腺癌患者的临床病理特征

a由于某特性未知，病例数并非总是81例；b由于某特性未知，病例数并非总是41例；c由于某特性未知，病例数并非总是40例；

*美国癌症联合会(AJCC)乳腺癌分期(2002年第6版)

1.2 石蜡包埋组织RNA的提取及其纯度鉴定 利用显微镜专用薄片切取机从石蜡包埋组织块的中央切取数片5～20 μm的组织薄片，严格按RecoverAllTMTotal Nucleic Acid Isolation Kit说明书(Applied Biosystems公司)操作，提取RNA；在全波长自动酶标仪260和280 nm波长处分别检测其吸光度(A)值，根据A260/A280鉴定RNA纯度和A260计算其浓度。

1.3 逆转录和PCR扩增 取1 μg总RNA，按Full SpectrumTMComplete Transcriptome RNA Amplification Kit(System Biosciences公司)说明书逆转录合成cDNA(20 μL)，用无核酸酶的水稀释至111 μL；再取其中102 μL cDNA作为模板加入到PCR反应体系(RT2Real-TimeTMSYBR Green PCR Master Mix)中至终体积2 700 μL，混匀后，在RT2ProfilerTMPCR Array System的96孔板(SABiosciences 公司)各孔中，加入25 μL等量的PCR反应体系，进行实时定量扩增。反应条件：95℃预变性10 min；95℃ 15 s、60℃ 1 min，50个循环 (BIO-RAD ICycle荧光定量扩增仪)。

PCR芯片(RT2ProfilerTMPCR Array System)是专为实时荧光定量PCR设计的96孔反应板，每孔中已预置了经过优化设计的用以扩增靶cDNA片段的上、下游引物；其设置顺序为：A1-G12孔包含了与乳腺癌转移相关的84个靶基因的引物；H1-H5孔包含了5个管家基因(β-2-微球蛋白，次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶，1、3-磷酸甘油醛脱氢酶，核糖体蛋白L13a和β-肌红蛋白)，用于靶基因定量数据的标化；H6为基因组DNA参照(GDC)，其中固定的引物能特异性地检测未转录的基因组DNA重复片段，以监测样本中是否存在DNA污染；H7到H9是3个重复孔，均为逆转录参照(RTC)，用于检测逆转录效率。H10到H12是阳性PCR参照(PPC)，用于反映PCR反应的效率；这两组重复的对照RTC和PPC也可用于监测芯片间和芯片内测定的一致性。

1.5 统计学分析 采用SPSS 13.0软件包，样本率的比较采用χ2检验。各靶基因表达的定量数据经检验为非正态分布；靶基因表达水平的高低分界(Cut-off值)采用的是所有病例(包括研究组和对照组)检测结果的中位数。

2 结果

2.1 总RNA的提取质量 抽提81份样本总RNA，A260/A280均在1.63～2.01之间；且所有样本的5个管家基因RT-PCR检测，除14份样本有1个管家基因、10份样本有2个管家基因以及3份样本有3个管家基因没有检测到扩增信号外，其余均有典型的扩增曲线，说明抽提的RNA质量符合要求。

2.2 RT-PCR芯片测定结果 图1显示的是1例复发患者样本的96孔板1次检测的扩增曲线，其中的5个管家基因和7个质控对照均符合试剂盒的测定要求。研究组与对照组相比较，在84个已知靶基因中，有12个基因的表达改变具有统计学意义(14.3%；P<0.05；表2)。其中9个基因表达上调(10.7%)，包括AR、CCNA2、CCND1、CD44、HMGB1、MKI67、NFYB、NGFR和TOP2A；3个基因表达下调(3.57%)，包括ESR2、SPRR1B和KLF5。这些基因主要涉及细胞增殖、分化和凋亡，细胞迁移和粘附，细胞周期调控以及细胞内激素信号传导等功能。

图1 1例复发患者样本的96孔板1次检测的扩增曲线

基因代码高表达%(n/n)未复发复发低表达%(n/n)未复发复发P值基因代码高表达%(n/n)未复发复发低表达%(n/n)未复发复发P值AR37．5(15/40)62．5(25/40)61．0(25/41)39．0(16/41)0．035IL6R50．0(20/40)50．0(20/40)48．8(20/41)51．2(21/41)0．913BAD52．5(21/40)47．5(19/40)46．3(19/41)53．7(22/41)0．579IL6ST55．0(22/40)45．0(18/40)43．9(18/41)56．1(23/41)0．318BAG158．5(24/41)41．5(17/41)40．0(16/40)60．0(24/40)0．950ITGA642．5(17/40)57．5(23/40)56．1(23/41)43．9(18/41)0．221BCL252．5(21/40)47．5(19/40)46．3(19/41)53．7(22/41)0．579ITGB442．5(17/40)57．5(23/40)56．1(23/41)43．9(18/41)0．221BCL2L255．0(22/40)45．0(18/40)43．9(18/41)56．1(23/41)0．318JUN47．5(19/40)52．5(21/40)51．2(20/41)48．8(21/41)0．738C350．0(20/40)50．0(20/40)48．8(20/41)51．2(21/41)0．913KIT47．5(19/40)52．5(21/40)51．2(21/41)48．8(20/41)0．738CCNA142．5(17/40)57．5(23/40)56．1(23/41)43．9(18/41)0．221KRT1843．6(17/39)56．4(22/39)54．8(23/42)45．2(19/42)0．315CCNA233．3(13/39)66．7(26/39)64．3(27/42)35．7(17/42)0．005KRT1948．7(19/39)51．3(20/39)56．1(21/42)43．9(21/42)0．908CCND137．5(15/40)62．5(25/40)61．0(25/41)39．0(16/41)0．035MAP2K741．5(17/41)58．5(24/41)57．5(23/41)42．5(17/41)0．149CCNE147．5(19/40)52．5(21/40)51．2(21/41)48．8(20/41)0．738MKI6737．5(15/40)62．5(25/40)61．0(25/41)39．0(16/41)0．035CD4433．3(13/39)66．7(26/39)64．3(27/42)35．7(15/42)0．005MT353．7(22/41)46．3(19/41)45．0(18/40)55．0(22/40)0．436CDH147．5(19/40)52．5(21/40)51．2(21/41)48．8(20/41)0．738MUC155．0(18/40)55．0(22/40)53．7(22/41)46．3(19/41)0．436CDKN1A55．0(22/40)45．0(18/40)43．9(18/41)56．1(23/41)0．318NFYB37．5(15/40)62．5(25/40)61．0(25/41)39．0(16/41)0．035CDKN1B52．5(21/40)47．5(19/40)46．3(19/41)53．7(22/41)0．579NGF45．0(18/40)55．0(22/40)53．7(22/41)46．3(19/41)0．707CDKN2A47．5(19/40)52．5(21/40)51．2(21/41)48．8(20/41)0．738NGFR36．3(15/40)63．4(26/40)62．5(25/41)37．5(15/41)0．020CLDN752．5(21/40)47．5(19/40)46．3(19/41)53．7(22/41)0．579NME160．0(24/40)40．0(16/40)39．0(16/41)61．0(25/41)0．059CLU52．5(21/40)47．5(19/40)46．3(19/41)53．7(22/41)0．579PAPPA45．0(18/40)55．0(22/40)53．7(22/41)46．3(19/41)0．436COL6A147．5(19/40)52．5(21/40)51．2(21/41)48．8(20/41)0．738PGR42．5(17/40)57．5(23/40)56．1(23/41)43．9(18/41)0．221CTNNB142．5(17/40)57．5(23/40)48．8(23/41)56．1(18/41)0．221PLAU55．0(22/40)45．0(18/40)43．9(18/41)56．1(23/41)0．318CTSB50．0(20/40)50．0(20/40)48．8(20/41)51．2(21/41)0．913PTEN50．0(20/40)50．0(20/40)48．8(20/41)51．2(21/41)0．913CTSD52．5(21/40)47．5(19/40)46．3(19/41)53．7(22/41)0．579PTGS247．5(19/40)52．5(21/40)51．2(21/41)48．8(20/41)0．738

续表

基因代码高表达%(n/n)未复发复发低表达%(n/n)未复发复发P值基因代码高表达%(n/n)未复发复发低表达%(n/n)未复发复发P值CYP19A140．0(16/40)60．0(24/40)58．5(24/41)41．5(17/41)0．095RAC242．5(17/40)57．5(23/40)56．1(23/41)43．9(18/41)0．221DLC147．5(19/40)52．5(21/40)51．2(21/41)48．8(20/41)0．738RPL2747．5(19/40)52．5(21/40)51．2(21/41)48．8(20/41)0．738EGFR57．5(23/40)42．5(17/40)41．5(17/41)58．5(24/41)0．149SCGB1D245．0(18/40)55．0(22/40)53．7(22/41)46．3(19/41)0．436ERBB250．0(20/40)50．0(20/40)48．8(20/41)51．2(21/41)0．913SCGB2A147．5(19/39)51．3(20/39)50．0(21/42)50．0(21/42)0．908ESR155．0(22/40)45．0(18/40)43．9(18/41)56．1(23/41)0．318SERPINA338．5(15/39)61．5(24/39)59．5(25/42)40．5(17/42)0．058ESR262．5(25/40)37．5(15/40)36．6(15/41)63．4(26/41)0．020SERPINB547．5(23/39)52．5(16/39)40．5(17/42)59．5(25/42)0．096FAS52．5(21/40)47．5(19/40)46．3(19/41)53．7(22/41)0．579SERPINE151．3(20/39)48．7(19/39)47．6(20/42)52．4(22/42)0．742FASLG50．0(20/40)50．0(20/40)48．8(20/41)51．2(21/41)0．913SLC7A545．0(18/40)55．0(22/40)53．7(22/41)46．3(19/41)0．436FGF143．2(16/37)56．8(21/37)54．5(24/44)45．5(20/44)0．311SPRR1B62．5(25/40)37．5(15/40)36．6(15/42)63．4(26/42)0．020FLRT140．0(16/40)60．0(24/40)58．5(24/41)41．5(17/41)0．913STC247．5(19/40)57．5(21/40)51．2(21/41)48．8(20/41)0．738FOSL160．0(24/40)40．0(16/40)39．0(16/41)48．8(25/41)0．059TFF150．0(20/40)50．0(20/40)48．8(20/41)51．2(21/41)0．913GABRP40．0%(16/40)60．0(24/40)58．5(24/41)41．5(17/41)0．095TGFA50．0(20/40)50．0(20/40)48．8(20/41)51．2(21/41)0．913GATA359．0(23/39)41．0(16/39)40．5(17/41)59．5(25/41)0．096THBS148．7(16/40)51．3(24/40)50．0(21/41)50．0(21/41)0．908GNAS47．5(19/40)52．5(21/40)51．2(21/41)48．8(20/41)0．738THBS245．0(18/40)55．0(22/40)53．7(22/41)46．3(19/41)0．436GSN52．5(21/40)47．5(19/40)46．3(19/41)53．7(22/41)0．579TIE152．5(21/40)47．5(19/40)46．3(19/41)53．7(22/41)0．579HMGB135．0(14/40)65．0(26/40)63．4(26/41)36．6(15/41)0．011TNFAIP252．5(21/40)47．5(19/40)46．3(19/41)53．7(22/41)0．579HSPB140．0(16/40)60．0(24/40)58．5(24/41)41．5(17/41)0．095TOP2A35．0(14/40)65．0(26/40)63．4(26/41)36．6(15/41)0．011ID250．0(20/40)50．0(20/40)48．8(20/41)51．2(21/41)0．913TP5347．5(19/40)52．5(21/40)51．2(21/41)48．8(20/41)0．738IGFBP252．5(15/40)61．5(24/40)59．5(25/41)40．5(17/41)0．058VEGFA52．5(21/40)47．5(19/40)46．3(19/41)53．7(22/41)0．579IL2RA45．0(18/40)55．0(22/40)53．7(22/41)46．3(19/41)0．436KLF560．0(25/39)40．0(14/39)35．7(15/41)64．3(27/41)0．011IL651．3(20/39)52．5(19/39)47．6(20/42)52．4(22/42)0．742KLK560．0(24/40)40．0(16/40)39．0(16/41)48．8(25/41)0．059

3 讨论

实时定量PCR是目前公认的检测基因表达最灵敏、最可靠的方法，其线性范围广(5个数量级)，可以检测同一样本中表达量极低和表达量很高的基因，常用于验证基因芯片结果的有效性；但缺点是每次实验只能检测少数几个基因的表达水平，若要检测大量基因，则工作量巨大，耗时费力。本文所采用的RT2Profiler PCR芯片技术结合了实时定量PCR的优点和芯片的高通量，1次可同时检测84个基因，且同步扩增的5个管家基因和7个质控对照，可有效监测结果的假阴性、假阳性、重复性以及转录和扩增效率，从而确保了检测质量。

乳腺癌是一种性激素依赖性肿瘤，其发生、发展与性激素受体状况密切相关。据报道AR(雄激素受体)在70%以上乳腺癌以及45%～50%雌激素受体(ER)阴性乳腺癌患者中表达[2]。在本研究中，AR在乳腺癌术后复发患者中表现为高表达，可能与雄激素可促进乳腺癌形成并加速其发展的作用有关。Moinfar等[3]报道ER、PR(孕激素受体)阴性而AR阳性乳腺癌患者，癌细胞分化低恶性程度高。

近年来，人们发现细胞周期失控是癌变的重要原因，并进一步揭示肿瘤的发生发展主要是G1～S期的转换失调[4]。在本组乳腺癌术后复发患者中，与细胞周期G1/S期阻滞有关的CCNA2(细胞周期蛋白A2，又称Cyclin A2)和CCND1(Cyclin D1)基因表达明显上调；他们可导致癌细胞周期失控，出现以增殖为主的失控性生长[5]；同时，与细胞迁移及粘附有关的基因如HMGB1(高迁移率族蛋白B1)和CD44(粘附分子跨膜糖蛋白)的高表达，又促进了这些快速增长的癌细胞向宿主细胞及其基质迁移、粘附和转移的过程[6]。此外，筛选出来的上调基因还有MKI67(核增殖抗原)、NFYB(核转录因子Y，β)和NGFR(神经生长因子受体)，据报道也与癌细胞的生长、增殖和转移密切相关[1，7]。乳腺癌细胞能分泌神经生长因子(NGF)并表达NGFR，而正常乳腺上皮细胞不能分泌NGF，但能表达NGFR；有趣的是，NGF只能与乳腺癌细胞上的NGFR结合，发挥促进细胞的有丝分裂和抗凋亡生物学效应，而对正常乳腺上皮细胞则没有此作用[7]。Adriaenssens等[8]研究发现，以NGF为靶点的治疗，可有效抑制乳腺癌细胞的增殖和转移，同时还可促进细胞凋亡和抑制肿瘤血管生成。

上调基因TOP2A(拓扑异构酶IIα)是近年乳腺癌研究的热点。2008年美国食品药品管理局(FDA)批准了名为TOP2A FISH pharmDx的试剂盒，用于评估相对高风险乳腺癌患者的肿瘤复发风险和长期生存率。美国临床学会(ASCO)2008国际乳腺癌专题研讨会上，北美乳腺癌协作组的一项研究表明，对于激素受体阳性、Her-2正常患者，TOP2A基因RNA表达与复发高度相关(校正P=0.01)，多变量分析表明，TOP2A表达每增加5单位，复发风险比(HR)为5.6(P=0.008)[9]。

下调基因有ESR2(雌激素受体2)、SPRR1B(small proline-rich protein 1B)和KLF5(krupple like factor 5)。雌激素受体(ER)是一个核转录因子，调控基因表达，雌激素通过ER介导的信号传导在乳腺癌的发生发展中起重要作用。王殊等[10]研究发现ER1在乳腺癌组织的表达明显高于癌旁正常组织，而ER2在癌组织的表达明显低于癌旁正常组织，ER1/ER2比值在癌组织中明显增高；如果ER2水平下调，其对ER1的抑制作用减弱，可导致细胞对雌激素的敏感性增加，促进肿瘤发生发展。SPRR1B是鳞状细胞化生的一个生物学标志，在皮肤和呼吸道鳞状上皮细胞的分化中起重要作用。最近，Tesfaigzi等[11]报道SPRR1B在非鳞状细胞(如腺癌细胞)中也有表达，其过表达可促进细胞进入G0期，低表达很可能加快细胞进入增殖期。KLF5是KLF家族中与胚胎发育、细胞增殖和肿瘤发生密切相关的转录调节因子，其在乳腺癌中的作用，近年来也受到广泛关注，多数研究的重点是KLF的致癌机制。也有些研究[12]认为KLF5表达与癌细胞增殖活性直接相关，可作为乳腺癌新的预后因子。不过，这些研究目前主要局限于西方国家，结果也存在着不一致，需要进一步在多种族人群中开展研究。

综上所述，本研究的结果初步表明，乳腺癌的术后复发转移涉及到一些基因的表达改变，对这些基因的进一步深入研究无疑有助于乳腺癌复发机制的阐明，并为临床更有效的预防和治疗奠定基础。

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