王建宁， 周荣平， 苗莹莹

胃癌主要扩散形式是淋巴转移，淋巴转移是影响胃癌患者预后的重要因素。血管内皮生长因子C (vascular endothelial growth factor-C, VEGF-C)是诱导淋巴管生成的生长因子，其受体3 (VEGFR-3)是成熟淋巴管内皮细胞的特异性标记物，VEGF-C/VEGFR-3调控系统可能参与肿瘤间质淋巴管生成及淋巴道转移过程[1]。本实验采用RT-PCR法和Western Blot法检测VEGFR-3的表达情况，探讨其与胃癌各项临床病理特征的关系，为研究胃癌的发生发展和淋巴转移机制及抗淋巴转移治疗提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 组织标本 收集南京江宁医院普外科2009年3月至2009年7月手术切除的32例胃癌组织及其癌旁组织(距离肿瘤组织5 cm以上)。男23例，女9例；年龄42～72岁，平均59岁。术前均未放化疗。术后经病理证实为腺癌，相应癌旁组织均未见癌累及。肿瘤≥5 cm 14例，<5 cm 18例；中低分化20例，高分化12例；穿透浆膜6例，未穿透浆膜26例；有淋巴结转移15例，无淋巴结转移17例；有远处转移5例，无远处转移27例；TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期22例，Ⅲ、Ⅳ期10例。于肿瘤切除后立即在无菌条件下切取肿瘤及距肿瘤5 cm以上的相应癌旁组织分别放入2个无核酶冻存管中，做好标记放置于液氮中保存。

1.2 主要试剂 兔抗人VEGFR-3(Flt4)多克隆抗体购自福州迈新公司，碱性磷酸酶标记羊抗兔二抗购自北京中杉金桥公司，氯化硝基四氮唑/对甲苯胺蓝(NBT/BCIP)为美国Sigma公司产品。

1.3 方法 剪取少量组织块，每份加入0.5 mL匀浆液进行匀浆。离心取上清,通过 Lowry法( Folin酚法)测定蛋白质含量，每次均取50 μg总蛋白样品 40 μL上样量在 7.5% SDS-PAGE进行电泳分离，经电转仪转至硝酸纤维素膜。然后用5%脱脂奶粉室温封闭5 h，弃溶液，加入用 5%脱脂奶粉稀释的兔抗人VEGFR-3抗体(1∶2 000稀释)，室温轻摇过夜。三羟甲基氨基甲烷碱缓冲液(TBST)洗膜3次，加入用5%脱脂奶粉稀释的碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG(1∶500稀释)，室温轻摇2 h，TBST液洗膜3次后，NBT/BCIP显色。Image J软件分析目的蛋白条带与β-actin的灰度比值。

1.4 统计学分析

2 结果

Western Blot结果显示胃癌组织中，VEGFR-3蛋白在胃癌组织中的表达量为2.34±4.96，在癌旁组织中的表达量为0.40±0.08，两者差异具有统计学意义(P<0.05)(图1)。VEGFR-3蛋白在胃癌组织中的表达与TNM分期有关，分期越晚，表达量越高(P<0.05)；且肿瘤浸润越深，表达量越高(P<0.05)；并且有淋巴结转移和有远处转移组表达量显著高于无淋巴结转移和无远处转移组(P<0.05)；但是VEGFR-3蛋白的表达与肿瘤大小、分化程度无关(P>0.05)(表1)。

图1 VEGFR-3蛋白在胃癌及相应癌旁组织中的表达

临床病理特征例数(n)VEGFR⁃3蛋白相对表达量P值肿瘤大小0．57 <5cm180．71±0．07 ≥5cm140．70±0．08分化程度0．11 高分化120．66±0．06 中低分化200．69±0．06穿透浆膜0．01 无260．69±0．07 有60．86±0．12淋巴结转移0．02 无170．68±0．07 有150．79±0．09远处转移0．02 无270．69±0．07 有50．77±0．08TNM分期0．03 Ⅰ、Ⅱ220．68±0．06 Ⅲ、Ⅳ100．74±0．08

3 讨论

肿瘤的发生发展及其侵袭转移是一个多因素、多阶段的复杂过程，而淋巴管的生成是其中的重要阶段。VEGFR-3是血管内皮生长因子家族的第三个受体酪氨酸激酶，广泛表达于胚胎发育期的血管内皮细胞，在成人组织中仅限表达于淋巴管内皮细胞，是淋巴管内皮特异性标志。VEGFR-3在许多恶性肿瘤中高表达，VEGFR-3与VEGF-C、VEGF-D结合后，信号转导改变，诱导淋巴内皮细胞增殖、迁徙，诱导淋巴管新生，促进肿瘤细胞的侵袭和转移[1-4]。VEGFR-3诱导生成的淋巴管结构不同，由一层极薄的没有基底膜的内皮细胞排列而成，通透性极高，是肿瘤细胞发生粘附、穿入并转移到远处淋巴结的形态学基础。同时VEGFR-3与其配体还可以相互作用，调节淋巴管内皮细胞的生长，促进增殖、抑制凋亡，从而具有更高的增殖活性及浸润性[5]。Sun等[6]对82例非小细胞肺癌的研究结果显示VEGFR-3阳性表达的病例具有较高的lymphatic vessel density (LVD)，且与病例的病理分期和淋巴结转移情况及预后有关。Roberts等[7]的动物实验研究显示VEGFR-3可以介导乳腺癌的淋巴转移和肺转移，而通过对其抑制可以降低转移风险。本实验从基因和蛋白的水平分别揭示了VEGFR-3在胃癌组织中的表达显著高于癌旁组织，且表达水平与淋巴结转移、临床分期等因素有关。

综上，VEGFR-3的阳性表达可作为预测胃癌淋巴结转移的指标，抗VEGFR-3抗体有可能抑制胃癌新生淋巴管形成，阻止胃癌的淋巴结转移，针对VEGFR-3的基因治疗亦会成为胃癌治疗中的重要方法。

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[6] Sun JG, Wang Y, Chen ZT, et al. Detection of lymphangiogenesis in non-small cell lung cancer and its prognostic value[J]. J Exp Clin Cancer Res, 2009, 28:21.

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