陈艳阁 汪海峰

摘 要 作为三维（3D）细胞培养技术之一的3D无支架培养技术，其广泛应用于肿瘤3D细胞模型的构建之中。了解当前肿瘤细胞3D无支架培养技术的应用情况，以及肿瘤3D细胞模型的构建成果对于抗癌药物的研发与评价很重要。本文介绍了构建肿瘤3D细胞模型的超低吸附着板培养法、悬滴培养法、磁悬浮培养法和旋转式细胞培养系统以及它们的局限性，并简述了肿瘤3D细胞模型用于药效评价的新进展，以期为肿瘤3D细胞模型的构建及抗癌药的药效评价提供参考。

关键词 3D肿瘤细胞模型 无支架细胞培养技术 药效评价

中图分类号：R965 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2024）01-0075-05

引用本文 陈艳阁， 汪海峰. 肿瘤细胞3D无支架培养技术研究进展及其在药效评价中应用[J]. 上海医药， 2024， 45（1）： 75-79.

基金项目：辽宁省教育厅科学研究经费项目青年科技人才“育苗”项目（LQ2020021）

Research progress in 3D scaffold-free culture of tumor cell and its application in pharmacodynamic evaluation

CHEN Yange， WANG Haifeng

（College of Chemical Engineering， Shenyang University of Chemical Technology， Shenyang 110142， China）

ABSTRACT As one of the three-dimensional （3D） cell culture technologies， the 3D scaffold-free culture technology is widely used in the construction of tumor 3D cell models. It is important to understand the current application of tumor cell 3D scaffold-free culture techniques and the results of tumor 3D cell model construction for the development and evaluation of antitumor drugs. This article introduces the ultra-low attachment plates culture， hanging drop technique， magnetic levitation culture and rotary cell culture system for constructing a 3D cell model of tumors and their limitations， and outlines some new progress of the application of 3D cell models in the pharmacodynamic evaluation so as to provide reference for the construction of 3D cell models of tumors and the efficacy evaluation of anticancer drugs.

KEY WORDS 3D tumor cell model； scaffold-free cell culture techniques； pharmacodynamic evaluation

在抗肿瘤药物的研发中，离不开模型的选择与建立，相关的模型有传统的二维细胞模型、动物模型以及新兴起的三维（3D）细胞模型。3D细胞模型因为能更好地模拟体内细胞微环境、更接近于人体内真实情况、且遵循3R原则而被越来越多研究人员所选择[1]。构建肿瘤的3D细胞模型可以更加有利于研究肿瘤的发生发展、肿瘤药物的研发与评价。但是肿瘤3D细胞培养技术还处于初级探索阶段，对于细胞适合的培养方法、培养条件、细胞球维持时间上、细胞球保存方法[2]、细胞球观察[3]还有待研究。肿瘤3D细胞模型的构建可以分为有支架细胞培养技术和无支架细胞培养技术，基于无支架细胞培养技术的肿瘤3D细胞模型研究成本低、操作简单可以批量生产。本文综述了肿瘤3D细胞模型无支架细胞培养技术的4种类型，即超低吸附法培养、悬滴培养法、磁悬浮培养法及旋转式细胞培养系统，探讨基于无支架细胞培养技术的肿瘤3D细胞模型的构建条件，以及这类肿瘤3D细胞模型在抗肿瘤药物的药效评价方面应用。

1 无支架细胞培养技术

简单来说，无支架细胞培养技术就是让肿瘤细胞自发聚集在一起，形成类似于球形的细胞团[4]。无支架细胞培养技术可以分为利用超低吸附减少细胞附着的超低附着板培养法、利用重力和液面表面张力的悬滴培养法、利用磁场使得磁化后的细胞自发成球的磁悬浮培养法、利用旋转产生失重的旋转式细胞培养系统等。

1.1 超低吸附着板培养法

384孔板比96孔板更有利于乳腺癌细胞成球，并且基质凝胶与生长因子配比对于细胞成球效果有影响[5]。不同细胞系形成的细胞球形态不同，Malh？o等[6]利用超低吸附孔板培养MCF7、MDA-MB-231和SKBR3肿瘤细胞和MCF12A非肿瘤细胞，发现 MCF7和MDAMB-231的细胞球较为致密，而SKBR3和MCF12A形成的细胞球较为松散，对细胞球内的细胞进行观察，发现MCF7在第3天已经出现腺泡结构的特征。

张静等[7]研究发现细胞球大小与接种浓度成线性关系，并且噻唑蓝法比酸性磷酸酶法更适合3D活力测定。冯珊珊等[8]將人肝癌细胞和人肝星形细胞接种到超低吸附孔板中共培养，并对细胞球石蜡切片方法进行优化，缩短了制片时长和简化了操作流程。杜鸣等[9]在96孔板中培养食管鳞癌细胞球，并且发现脐带间充质干细胞上层清夜可以促进细胞球的生长和形态的维持。

1.2 悬滴培养法

进行悬滴培养法时培养基容易蒸发，Jeong等[10]评估了培养基蒸发率，并利用人类结直肠癌细胞（HCT116）首次培养出直径超过1.5 mm的大型肿瘤3D细胞模型。光动力疗法是治疗癌症的方法之一[11]。有研究者利用悬滴法构建多个黑色素瘤，发现黑色素瘤能够在人工真皮中侵袭并且增殖，经光动力疗法后肿瘤细胞增殖能被有效抑制，为光动力疗法的有效性提供了实验依据[12]。Badea等[13]利用悬滴培养法培养乳腺癌细胞MDA-MB-231，观察发现接种量为8 000细胞/滴时可获得致密型细胞球，接种量为2 500、5 000细胞/滴时可获得疏松型细胞球，而且NRF2和Hsp70蛋白可作为MDA-MB-231 3D细胞模型形成的分子标志物，为设计抗肿瘤药物提供新靶点。

将结肠癌HT-29细胞悬液滴在聚四氟乙烯粉末上的悬滴培养法，和PDMS铺在在普通96孔板底部的超低吸附培养法，在激光共聚焦显微镜下观察，发现两种方法与2D细胞模型形态不同，表明两种方法均能成功构建出结肠癌HT-29的3D细胞模型[14]。

超低吸附着板培养法和悬滴培养法应用于3D细胞模型的构建比较广泛[15]，但在利用超低吸附着板培养法和悬滴培养法两种方法培养肾上腺皮质癌、垂体神经内分泌瘤和嗜铬细胞瘤3D模型时，发现两种培养模式下的肿瘤3D细胞模型效果不佳，其中垂体神经内分泌瘤更适合用有支架细胞培养技术来培养[16]。

1.3 磁悬浮培养法

磁悬浮培养法就是通过磁力将被磁化的细胞聚集一起的细胞培养方法[17]，其克服了细胞球容易解体及维持时间短的缺点[18]。Onbas等[19]证明在磁悬浮装置中改变培养时间、磁性剂浓度对于3D细胞模型的大小有影响，并用磁悬浮培养法构建了人上皮乳腺腺癌MCF7和MDA-MB-231、人骨髓神经母细胞瘤SH-SY5Y、大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC-12和人上皮宮颈腺癌HeLa的3D细胞模型。Türker等[20]对悬浮装置进行了改进，促进了NIH 3T3小鼠成纤维细胞与HCC 827非小细胞肺癌细胞间的相互作用，从而形成3D细胞模型。磁悬浮法作为新兴起培养技术，不仅须考虑其磁性材料对细胞毒性大小的影响，还须考虑可操作空间是否满足操作要求[21]。

1.4 旋转式细胞培养系统

目前，对于生物反应器的改进是研究热点之一[22]，其在多功能干细胞培养中应用较多，可以诱导多功能干细胞分化成心肌细胞[23-24]及用于CAR-T 细胞的大规模培养[25]。

旋转式细胞培养系统是生物反应器的一种，其可以提供失重环境，有利于生物标志物的发现。在旋转式细胞培养系统培养72 h后，胶质母细胞瘤细胞系U87MG 3D细胞模型形态学变化，细胞球的形态学的变化使得细胞的生长特征也发生改变。用免疫印迹法检测发现U87MG细胞中蛋白表达也发生变化，U87MG细胞中的PCNA蛋白和Bcl-2蛋白可成为胶质母细胞瘤的生物标志物[26]。

旋转式细胞培养系统虽然可以用来研究失重对于细胞的影响，但是利用旋转式细胞培养系统还须考虑设备的成本和灭菌工作[27]。

2 基于肿瘤3D细胞模型的药效评价

对于肿瘤药物的药效评价，现在很多研究证实3D细胞模型与2D细胞模型有着显著差异[28-29]。所以可以用肿瘤3D细胞模型来评价抗肿瘤药物的药效，以便获得更加精确的数据。

张弛等[30]在超低吸附圆底96孔板中构建出HepaRG细胞的3D细胞模型，在不同浓度的曲格列酮药物作用后，发现线粒体中活性氧自由基水平随着曲格列酮药物浓度的增加而增加，曲格列酮可能通过影响线粒体而发挥药效。赵富周等[31]在超低吸附孔板培养了A549及H1650细胞的3D细胞模型，用于对异牡荆素的影响和作用机制进行探究，发现异牡荆素可以有效地降低细胞球成球率及细胞活性。

用96孔悬滴板、24低附着孔板和96超低吸附孔板来培养BON1细胞，并对不同浓度的舒尼替尼进行药效评价，药物对于悬滴培养法培养的细胞球周长没有显著差别，但在24和96孔板中，细胞球体周长均减少，然而24孔板培养的细胞球比96孔板培养的细胞球在数据收集方面操作困难，所以96超低吸附孔板更适合BON1细胞球的构建及舒尼替尼药效评价[32]。

对氟尿嘧啶和伊立替康两种药物进行药效评价，发现氟尿嘧啶主要抑制胞球外层细胞生长，而伊立替康比氟尿嘧啶更有效地渗透到细胞球内部，从而影响整个细胞球的生长，最终使致密结构的细胞球崩解[14]。

有文献提出可将患者的细胞体外培养来评价肿瘤细胞对于药物的耐药性，做到精准治疗，由患者来源的胶质母细胞瘤细胞来构建3D细胞模型，将细胞接种到专用于悬浮培养的细胞培养瓶中培养，发现细胞球对于替莫唑胺表现出更强的耐药性[33]。

肿瘤3D细胞模型还可以对于候选药物的药效进行评估，Jouberton等[34]建立了一个操作简单、重复性高的前列腺癌3D细胞模型，并对多西紫杉醇和前药TH-302进行评价，随着3D细胞模型体积的增加多西紫杉醇的耐药性增强，而低氧区域的增加则增强了TH-302的活性。此外，用构建的3D细胞模型来检测药物与免疫疗法的结合也为新药研发提供了参考，在研究BH3模拟物（BH3 mimetics）与自然杀伤（NK）细胞免疫疗法结合使用时，发现BH3模拟物和免疫细胞联合使用比单独使用药物或者添加免疫细胞更能引起肿瘤细胞发生凋亡，联合使用也降低了BH3模拟物的细胞毒性[35]。

3 展望

尽管肿瘤3D细胞模型的构建受到了广泛的关注，但是无支架细胞培养技术在构建肿瘤3D细胞模型中仍然有缺点，包括形成的球形不规则、细胞球的大小受到限制、维持时间短等。随着精准医疗的发展，对于细胞模型的可重复性及监测性要求更为严格[36]。细胞球之间融合方式和融合时信息交流及不同细胞系间融合速率快慢的探究，更加有助于了解肿瘤发生发展过程。所以，作为新兴起的3D细胞模型仍然需要大量的实验研究来探索每类肿瘤细胞最适合的3D细胞培养方法。并且选择适合的培养方法来构建3D细胞模型，除了可缩短实验研究到临床应用所需时间以外，还使得研究结果更加精确，更有利于医药行业的发展。

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