李诗颖 李存雅 张雪 钟薏

摘 要 目的：多項研究提示，西红花提取物能影响肿瘤的发展进程。本实验探究西红花提取物在肺腺癌小鼠模型中对肿瘤免疫微环境和免疫治疗的影响，为西红花提取物抗肿瘤研究提供更多基础性数据。方法：构建Lewis肺癌细胞和萤光素酶稳定结合的小鼠皮下瘤模型，观察西红花提取物对小鼠皮下瘤和肿瘤免疫微环境的影响：运用活体成像技术跟踪肿瘤生长情况；运用流式细胞技术检测小鼠CD4+、CD8+ T细胞的数量及占比；运用反转录-聚合酶链式反应技术检测程序性死亡受体配体1、含有T细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域的蛋白3（T cell immunoglobulin and mucin domaincontaining protein 3， TIM3）、淋巴细胞活化基因-3（lymphocyte-activation gene-3， LAG3）、具有免疫球蛋白和ITIM结构域的T细胞免疫受体（T cell immunoreceptor with immunoglobulin and ITIM domain， TIGIT）、胸腺细胞选择相关的高迁移率族蛋白（thymocyte selection-associated high mobility group box， TOX）1、TOX2、TOX3基因的mRNA表达情况。结果：与对照组相比，给予西红花提取物能一定程度地抑制小鼠皮下瘤的生长（P<0.05），且小鼠CD4+、CD8+ T细胞的数量及占比均增加（P<0.05），TIM3、LAG3、TIGIT、TOX1、TOX2、TOX3的基因表达均上调（P<0.05）。结论：西红花提取物能提高肺腺癌免疫微环境中的CD4+、CD8+ T细胞的占比，增强免疫治疗的抗肿瘤作用，进而提高肺癌免疫治疗效果，抑制肺癌发展。

关键词 西红花 免疫微环境 肺腺癌 免疫治疗

中图分类号：R965； R282.71 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2024）01-0003-09

引用本文 李诗颖， 李存雅， 张雪， 等. 西红花提取物调控免疫细胞，提高程序性死亡受体-1抑制剂治疗肺腺癌效果的实验研究[J]. 上海医药， 2024， 45（1）： 3-11； 28.

基金项目：上海市2022年度“科技创新行动计划”医学创新研究专项项目（22Y31920104）；上海市虹口区第二轮“国医强优”三年行动计划（2022—2024年）中西医结合重点专科、薄弱专科建设项目（HKGYQYXM-2022-10）；上海市2021年度“科技创新行动计划”扬帆计划项目（21YF444400）；上海市2022年度“科技创新行动计划”启明星培育（扬帆专项）项目（22YF1444900）；山东省乡村振兴基金会张秀兰慈善基金项目

Experimental study of saffron extracts to modulate immune cells to improve the efficacy of a programmed death-1 inhibitor in the treatment of lung adenocarcinoma

LI Shiying1， LI Cunya1， ZHANG Xue2， ZHONG Yi1

（1. Department of Oncology， Shanghai TCM-Integrated Hospital， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 200082， China； 2. Shanghai Traditional Chinese Medicine Co.， Ltd.， Shanghai 200082， China）

ABSTRACT Objective： A number of studies have shown that saffron extracts can affect the development of tumor. This study explored the effect of saffron extract on tumor immune microenvironment and immunotherapy in a mouse model of lung adenocarcinoma so as to provide more basic data for the anti-tumor research of saffron extracts. Methods： The transplanted tumor model of Lewis lung carcinoma-luciferase in mice was established to detect the effect of saffron extracts on the transplanted tumor in vivo. At the same time， the tumor growth was tracked by in vivo imaging technique. The number and proportion of CD4+ and CD8+ T cells were determined by flow cytometry. The mRNA levels of programmed death-ligand 1， T cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein 3 （TIM3）， lymphocyte-activation gene-3 （LAG3）， T cell immunoreceptor with immunoglobulin and ITIM domain （TIGIT）， thymocyte selection-associated high mobility group box （TOX） 1， TOX2 and TOX3 were detected by reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR） and immunohistochemical techniques to verify the effect of saffron extracts on the regulation of tumor immune microenvironment. Results： Compared with the control group， the administration of saffron extracts could inhibit the growth of subcutaneous tumor in mice to a certain extent， and the number and proportion of CD4+ and CD8+ T cells were increased （P<0.05）， and the expression of genes encoding TIM3， LAG3， TIGIT， TOX1， TOX2 and TOX3 was up-regulated （P<0.05）. Conclusion： The saffron extracts can increase the proportion of CD4+ and CD8+ T cells in tumor microenvironment， enhance the anti-tumor effect of immunotherapy， thereby improving the effect of lung cancer immunotherapy and inhibiting the development of lung cancer.

KEY WORDS saffron； immune microenvironment； lung adenocarcinoma； immunotherapy

肿瘤是一类恶性疾病，2018年全球肿瘤死亡病例数达约960万人，较2008年增加26.3%，其中男性肿瘤死亡病例数增加最多的是肺癌，增加了23.4万人[1-2]。肺癌是肿瘤防治工作的重点之一。肿瘤免疫治疗是一种基于肿瘤生长受到免疫系统监视的理论而产生并不断发展的肿瘤治疗方法，其中免疫检查点抑制剂如程序性死亡受体-1（programmed death-1， PD-1）/程序性死亡受体配体1（programmed death-ligand 1， PD-L1）抑制剂、细胞毒T淋巴细胞相关抗原-4抑制剂等，已广泛用于多种肿瘤治疗，包括非小细胞肺癌治疗[3]，但免疫治疗仍存在耐药性和毒副反应问题。

西红花（saffron）为我国传统中药，其是鸢尾科番红花属多年生球茎草本植物番红花（Crocus sativus L.）的干燥柱头。目前，西红花的多种活性成分已被分离出来，主要包括西红花酸、西红花醛、西红花苷和西红花素等[4]。有研究显示，西红花提取物能影响肿瘤的发展进程，如西红花醛可通过下调核因子κB-κB抑制因子激酶和蛋白激酶B信号通路，抑制人前列腺癌细胞PC-3裸鼠皮下移植瘤的生长[5]。另有研究显示，西红花苷具有通过提高B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2， Bcl-2）蛋白相关X蛋白与Bcl-2蛋白的比值而抑制结直肠癌细胞生长和靶向p53蛋白而诱导胃癌细胞凋亡的作用[6-7]。

联合中医药或中药有效单体进行抗肿瘤治疗，提高肿瘤免疫治疗效果、降低毒副反应风险，这是当下中西医结合防治肿瘤领域的主要研究方向之一。本实验基于肿瘤微环境学说，探究西红花提取物在肺腺癌小鼠模型中对肿瘤免疫微环境和免疫治疗效果的影响，为西红花提取物抗肿瘤研究提供更多基础性数据。

1 材料与方法

1.1 细胞系及细胞培养

Lewis肺癌（Lewis lung carcinoma， LLC）细胞来源于中国科学院生物化学与细胞生物学研究所，所有LLC细胞系传代不超过6个月。

取LLC细胞构建LLC-萤光素酶（luciferase）细胞。

将LLC- luciferase细胞置于含有10%胎牛血清和0.1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中，放入37 ℃、5%二氧化碳培养箱培养，连续传代至细胞到达对数生长期后待用。

1.2 主要试剂与仪器

胎牛血清、DMEM培养基、磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline， PBS）购自美国GIBCO公司；D-荧光素鉀盐（XenoLight D-luciferin potassium salt）购自美国Perkin Elmer公司；异硫氰酸荧光素标记的抗小鼠CD3单克隆抗体、藻红蛋白标记的抗小鼠CD4单克隆抗体、别藻青蛋白标记的抗小鼠CD8单克隆抗体购自美国BioLegend公司；Trizol试剂购自美国Thermo Science公司；反转录试剂盒、SYBR Green聚合酶链式反应试剂盒购自大连的Takara公司；反转录-聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction， RT-PCR）引物由上海的Sangon Biotech公司设计并提供。

Lumina XR活体成像系统（软件：Lumina Ⅱ Living Image 4.3）购自美国Perkin Elmer公司；实时荧光定量聚合酶链式反应仪（型号：7500 Fast）购自美国ABI公司。

1.3 药物制备

西红花醇提物由上海市药材有限公司提供。该醇提物的提取率为45%，根据西红花饮片用量推算，小鼠用量为175.5 mg/kg，用生理盐水配制成浓度为21.9 mg/mL的溶液，保存于4 ℃冰箱中待用。

西红花醛由上海市药材有限公司提供。根据大鼠常规用量0.4 mg/kg和大、小鼠体表面积换算，小鼠常规用量为0.58 mg/kg，用生理盐水配制成浓度为0.145 mg/mL的溶液，保存于4 ℃冰箱中待用。

PD-1抑制剂卡瑞利珠单抗购自苏州盛迪亚生物医药有限公司。该药的常规用量为8 mg/kg，用生理盐水配制成浓度为2 mg/mL的溶液，保存于4 ℃冰箱中待用。

1.4 小鼠皮下瘤模型建立

54只C57BL/6J小鼠（雄性，4～6周龄，20～25 g），购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司[许可证号：SCXK（沪）2013-0016]，饲养于上海中医药大学实验动物中心[实验单位使用许可证号：SYXK（沪）2014-0008]，“无特定病原体”环境，温度（22±2）℃，相对湿度（55±5）%，光照/黑暗周期12/12 h。本实验通过上海中医药大学实验动物伦理委员会审查（伦理审查编号：PZSHUTCM210402011）。

为建立荷瘤小鼠模型，先将对数生长期的LLCluciferase细胞用0.25%胰蛋白酶消化，然后细胞计数，1 000 r/min离心处理5 min，弃上清液，再用PBS稀释至5×10⁶个细胞/mL浓度，取0.1 mL细胞悬液接种于小鼠右侧腋下。若接种后第5天，小鼠右侧腋下可触及大小均一的肿块，即造模成功。

根据实验目的，将荷瘤小鼠按体质量随机分组，共分为空白对照组、模型对照组、免疫治疗组、西红花醇提物组、西红花醇提物联合免疫治疗组、西红花醛组、西红花醛联合免疫治疗组7组，每组6只。对每组小鼠分别给予相应治疗共28 d。其中，对空白对照组和模型对照组，分别给予生理盐水灌胃[0.2 mL/（次？d）]和腹腔注射[0.1 mL/（次？3 d）]；对免疫治疗组，给予卡瑞利珠单抗腹腔注射[0.1 mL/（次？3 d）]；对西红花醇提物组，灌胃给药[0.2 mL/（次？d）]；对西红花醛组，腹腔给药[0.1 mL/（次？d）]；对西红花醇提物联合免疫治疗组，灌胃给予西红花醇提物[0.2 mL/（次？d）]和腹腔注射卡瑞利珠单抗[0.1 mL/（次？3 d）]；对西红花醛联合免疫治疗组，腹腔注射西红花醛[0.1 mL/（次？d）]和卡瑞利珠单抗[0.1 mL/（次？3 d）]。每天测量小鼠皮下瘤的长度和宽度，并称重。实验结束后，采用颈椎脱臼法处死小鼠，分离出移植瘤并称重。

1.5 活体成像检查

运用Lumina XR活体成像系统对荷瘤小鼠进行活体成像检查。检查前给小鼠腹腔或尾静脉注射萤光素酶10μL/g。注射后将小鼠置于麻醉机内，用2%异氟烷进行预麻醉，然后将小鼠放入活体成像设备内，用1%异氟烷维持麻醉状态，在距注射萤光素酶后约10 min小鼠荧光信号达到最强稳定平台期时，进行活体成像检查。

1.6 流式细胞检测

研磨制备各组小鼠脾脏组织的单细胞悬液，加入红细胞裂解液裂解红细胞，清洗、离心处理并用PBS洗涤多次后，分别加入异硫氰酸荧光素标记的抗小鼠CD3单克隆抗体、藻红蛋白标记的抗小鼠CD4单克隆抗体、别藻青蛋白标记的抗小鼠CD8单克隆抗体，4 ℃下孵育1 h，细胞再用PBS洗涤3次，加入PBS混匀，运用流式细胞仪（型号：BD FACSCantoⅡ）进行检测。

1.7 RT-PCR检测

使用Trizol试剂从荷瘤小鼠的肿瘤组织中提取总RNA，然后进行浓度和纯度检测。使用反转录试剂盒将1 μg总核糖核酸反转录成cDNA。使用SYBR Green聚合酶链式反应试剂盒20 μL反应体系进行实时荧光定量聚合酶链式反应。使用表1所示引物，对目的基因进行扩增，按以下步骤得到目的基因的扩增曲线和熔融曲线：95 ℃预变性10 min后，进入变性-退火-延伸循环。其中，95 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共进行40个循环。检测并记录各基因的Ct值。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， GAPDH）基因表达水平作为内源性对照，采用2-ΔΔCt方法计算相对基因表达水平。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 西红花提取物抑制荷瘤小鼠肿瘤发展

2.1.1 小鼠体质量

实验结束时，与空白对照组相比，各组小鼠的体质量均减轻，表明肿瘤是消耗性疾病。此外，与模型对照组相比，免疫治疗组小鼠的体质量增加，其余各治疗组小鼠的体质量减轻，但差异均无统计学意义（表2，P>0.05），表明西红花提取物的使用对荷瘤小鼠体质量没有显著影响，实验剂量的西红花提取物对小鼠安全。

2.1.2 瘤体质量

2.1.2.1 西红花醇提物

实验结束时，与模型对照组相比，免疫治疗组、西红花醇提物组、西红花醇提物联合免疫治疗组小鼠的瘤体质量均减轻，但差异均无统计学意义（表3，P>0.05）。小鼠瘤体质量符合实验动物福利伦理最新规定的要求[8]。

2.1.2.2 西红花醛

实验结束时，与模型对照组相比，西红花醛联合免疫治疗组小鼠的瘤体质量显著减轻，差异有统计学意义（表4，P<0.05），表明西红花醛有一定的抑制肿瘤发展作用。小鼠瘤体质量符合实验动物福利伦理最新规定的要求[8]。

2.2 西紅花提取物调节荷瘤小鼠免疫系统

2.2.1 西红花醇提物

实验结束时，与模型对照组相比，免疫治疗组小鼠脾脏组织中CD4+ T细胞的数量和CD8+ T细胞的数量及占比均增加，差异均有统计学意义（P<0.05）；西红花醇提物组和西红花醇提物联合免疫治疗组小鼠脾脏组织中CD8+ T细胞的数量及占比均增加，差异均有统计学意义（P<0.05）。这些数据（图1、2）表明，单独使用西红花醇提物、联合使用西红花醇提物和免疫治疗均能有效改善荷瘤小鼠机体的免疫功能。

2.2.2 西红花醛

实验结束时，与模型对照组相比，免疫治疗组小鼠脾脏组织中CD4+、CD8+ T细胞的数量均增加，差异均有统计学意义（P<0.05）；西红花醛联合免疫治疗组小鼠脾脏组织中CD4+ T细胞数量减少，差异有统计学意义（P<0.05）。此外，与免疫治疗组相比，西红花醛组小鼠脾脏组织中CD4+、CD8+ T细胞的数量均减少，差异均有统计学意义（P<0.05）；西红花醛联合免疫治疗组小鼠脾脏组织中CD8+ T细胞的数量及占比均减少，差异均有统计学意义（P<0.05）。这些数据（图3、4）表明，西红花醛调节荷瘤小鼠免疫功能的作用与西红花醇提物不同，有待进一步的实验研究。

2.3 西红花提取物调节肿瘤相关免疫抑制受体基因mRNA表达水平

2.3.1 西红花醇提物

实验结束时，与模型对照组相比，免疫治疗组小鼠TIGIT、TOX1、TOX2、TOX3的mRNA表达均上调，差异均有统计学意义（P<0.05）；西红花醇提物组小鼠LAG3、TIGIT、TOX1、TOX2的mRNA表达均上调，差异均有统计学意义（P<0.05）；西红花醇提物联合免疫治疗组小鼠LAG3、TIGIT、TOX1、TOX2、TOX3的mRNA表达均上调，差异均有统计学意义（P<0.05）。此外，与免疫治疗组相比，西红花醇提物组小鼠PD-L1 mRNA表达下调，但差异无统计学意义；LAG3 mRNA表达上调，差异有统计学意义（P<0.05）。详情见图5。

2.3.2 西红花醛

实验结束时，与模型对照组相比，西红花醛组小鼠LAG3、TIGIT、TOX1、TOX2的mRNA表达均上调，差异均有统计学意义（P<0.05）；西红花醛联合免疫治疗组小鼠LAG3、TIGIT、TOX1的mRNA表达均上调，差异均有统计学意义（P<0.05）。此外，与免疫治疗组相比，西红花醛组和西红花醛联合免疫治疗组小鼠PD-L1 mRNA表达均下调，但差异均无统计学意义。详情见图6。

3 讨论

肺癌的发病率和死亡率均很高，其是肿瘤防治工作的重点和难点。免疫治疗对肺癌有较好的效果，但仍存在耐药性和毒副反应问题。中医药作为中国传统文化的瑰宝，如何发挥中医药的独特优势来达到辅助提高免疫治疗效果、降低毒副反应的目的，是中西医结合防治肺癌领域的重要研究方向之一。

西红花在我国是珍稀药材，临床上用于多种疾病治療，包括抗肿瘤治疗。西红花苷作为西红花的主要有效成分之一，已被证实可通过降低炎症标志物环氧合酶-2、诱导型一氧化氮合酶、核因子κB、肿瘤坏死因子-α及其受体的活性而呈现抗肝细胞癌作用[9]。Samarghandian等[10-12]通过实验发现，西红花提取物对肺癌细胞有细胞毒活性，对正常细胞生长则无明显抑制作用。Liu等[13]验证了西红花提取物对肺癌细胞株A549和H446的抗增殖作用，并通过裸鼠皮下移植瘤模型从细胞凋亡的角度发现其可能是通过调控caspase-8/9/3通路而诱导肺癌细胞凋亡的。

本实验以肺腺癌为切入点，挖掘西红花提取物抑制肺癌发展的可能途经和提高肺癌免疫治疗效果的相关机制，以期为西红花提取物抗肿瘤研究提供更多的基础性数据。实验结果显示，与模型对照组相比，西红花醛和西红花醛联合免疫治疗均有一定的抑制肺癌模型小鼠瘤体生长的作用。此外，与模型 对照组相比，西红花醛组小鼠的体质量无明显改变，表明实验剂量的西红花醛对小鼠安全。

CD4+、CD8+ T细胞是参与机体T细胞免疫应答的细胞，是机体免疫微环境的主要组分之一，它们的占比能够反映机体的免疫状态，对机体的免疫功能起着重要作用。肿瘤患者的免疫功能与CD4+ T细胞与CD8+ T细胞的比值呈正相关关系[14-15]。有研究发现，西红花醇提物可抑制7，12-二甲基苯并蒽诱导的小鼠皮肤肿瘤发展：小鼠在肿瘤化疗的同时口服西红花醇提物，其生存期延长，骨髓抑制减轻，免疫功能改善[16]。本实验结果也显示，西红花提取物能提高肺癌模型小鼠的免疫功能，改善肺癌免疫微环境，从而抑制肺癌发展。

本实验还进行了基因层面的实验研究，结果显示与免疫治疗相比，西红花提取物虽能下调PD-L1 mRNA表达，但差异没有统计学意义，可能与本实验采用PD-1抑制剂作为对照，致使西红花提取物对肿瘤细胞PD-L1表达的影响不明显有关。此外，与模型对照组相比，各治疗组小鼠LAG3、TIGIT、TIM3的mRNA没有下调趋势，这可能与基因后续转录环节有关。有研究表明，LAG3的表达受转录水平调控[17]。另有研究发现，TIM3 mRNA表达与CD4+ T细胞的产生是同步的，TIM3 mRNA的表达可能会随CD4+ T细胞数量及占比的增加而上调[18]。至于TOX1、TOX2、TOX3的mRNA水平呈现上调趋势，可能与CD8+ T细胞占比增高有关[19]。

综上所述，西红花提取物能抑制肺癌发展，可能的作用机制是：提高肿瘤免疫微环境中的CD4+、CD8+ T细胞的数量及占比，增强免疫细胞的抗肿瘤效应，从而提高免疫治疗效果，抑制肺癌发展。但本实验未对西红花提取物的作用靶点进行蛋白层面的验证。后续除通过实验验证西红花提取物作用靶点的蛋白表达外，还将继续深入挖掘西红花提取物抑制肺癌发展的具体信号通路及其基因表达调控机制，为西红花提取物抗肿瘤研究提供更多基础性数据。

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