贺美婷,高静云,何明媚,潘海峰

1.承德医学院,河北 承德 067000; 2.河北省中药研究与开发重点实验室,河北 承德 067000

糖尿病是一种以血糖水平升高为特征的慢性代谢疾病,主要包括1型糖尿病和2型糖尿病。2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM),又称非胰岛素依赖型糖尿病,由胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗导致血糖水平升高。T2DM是最常见的糖尿病,约占所有糖尿病病例的90%。血糖可以直接反映糖尿病的情况,长期高血糖状态或血糖波动都会对机体造成一定程度的损坏,导致心脑血管、视网膜或肾脏等组织的功能减退或衰竭,进而引起一系列并发症,甚至导致死亡[1]。2021年12月6日,国际糖尿病联盟发布了第10版《全球糖尿病地图》,相关数据显示截至2021年,全球已有5.7亿成年人罹患糖尿病,中国已确诊及未确诊人数均位居全球第一,60岁以下人群中糖尿病相关死亡比例占3.9%[2]。由此可见,我国人民面临着糖尿病的严峻威胁,及早进行控糖防治已经成为重要的干预手段。

中药在治疗糖尿病及并发症方面展现出良好优势,《中国2型糖尿病防治指南(2020年版)》[3]对中医药防治糖尿病的作用也做出了肯定,因此开发中药潜力是目前最重要的任务之一。山楂叶是蔷薇科植物山里红(CrataeguspinnatifidaBge.var.majorN.E.Br.)或山楂(GrataeguspinnatifidaBge.)的干燥叶,味酸,性平,具有活血化瘀、理气通脉、化浊降脂的功效[4]。研究表明,山楂叶具有降血糖、调节糖脂代谢紊乱等作用[5],但其作用机制尚不明确。因此,本研究首先基于网络药理学和分子对接的方法预测山楂叶治疗T2DM的作用靶点,挖掘潜在活性成分;其次,通过BioGPS和The Human Protein Atlas数据库分析山楂叶抗T2DM的关键组织以及相关基因在关键组织的不同细胞中的分布情况,从而预测山楂叶通过“多成分-多组织-多通路-多靶点”途径防治T2DM的作用机制,为临床治疗提供理论基础和研究思路。

1 资料与方法

1.1 山楂叶活性成分筛选从中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP,http:www.tcmspw.com/tcmsp.php)、BATMAN(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)、HERB(http://herb.ac.cn/)、SymMap(http://www.symmap.org/)、TCM-ID(https://bidd.group/TCMID/)等数据库中检索山楂叶的化学成分,并根据已发表文献中总结的化学成分[6],共同构建山楂叶化学成分库并分类。从PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中获取各化学成分的Canonical SMILES码,将其导入SwissADME数据库进而筛选活性成分。筛选标准为:胃肠道吸收“GI absorption=high”且类药性“Druglikeness”中符合“Lipinski=yes”及至少另外一项规则为“yes”。

1.2 山楂叶潜在靶点预测将山楂叶活性成分的Canonical SMILES码导入Swiss Target Prediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/),设置物种为“Homo sapiens”,筛选出“Probability≥0.1”的靶点。除去重复靶点后导入UniProt数据库(https://beta.uniprot.org/)获得已被验证的人源UniProt ID,从而得到标准化后的山楂叶活性成分的潜在靶点。

1.3 T2DM相关靶点筛选以“type 2 diabetes mellitus”“T2DM”为关键词,利用DrugBank(https://go.drugbank.com/)、TTD(https://db.idrblab.net/ttd/)、GeneCards(https://www.genecards.org/)、CTD(https://ctdbase.org/)和OMIM(https://omim.org/mimmatch/)数据库检索相关靶点。在GeneCards得到的数据中剔除Description为空白的靶点,并选择Relevance score>22的靶点;在CTD中剔除“Direct Evidence”为空白的靶点,并选择Inference Score≥2的靶点。最后,去除重复靶点,合并整理,导入UniProt数据库进行标准化处理,得到T2DM疾病相关靶点。

1.4 蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络构建及关键靶点筛选利用Venny2.1.0获取山楂叶潜在靶点和T2DM相关靶点的交集靶点,并绘制韦恩图。将交集靶点上传至STRING数据库(https://cn.string-db.org/),设置物种为“Homo sapiens”且最低相互作用阈值为0.4,隐藏游离节点,得到PPI网络,下载TSV文件并导入Cytoscape 3.9.1进行拓扑分析和可视化。然后,基于Centiscape 2.2插件分析“Betweenness(中介中心性)”“Closeness(接近中心性)”“Degree(度值)”值,筛选大于中位值的靶点作为山楂叶抗T2DM的关键靶点。

1.5 活性成分-交集靶点网络构建及核心成分筛选将山楂叶活性成分和山楂叶-T2DM交集靶点导入Cytoscape3.9.1构建活性成分-交集靶点网络图。然后,基于CytoNCA插件分析活性成分-交集靶点网络图,得到“Betweenness”“Closeness”“Degree”值,筛选大于平均值的成分作为山楂叶抗T2DM的核心成分。

1.6 基因本体(gene ontology,GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析将山楂叶-T2DM交集靶点上传至DAVID 6.8数据库(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp),设置物种为“Homo sapiens”,进行GO功能分析和KEGG通路分析,以P<0.05为条件筛选结果并排序,取前30条KEGG结果和前10条GO结果绘制富集图,并将其作为山楂叶治疗T2DM的关键通路和功能。将关键靶点、核心成分和关键通路导入Cytoscape 3.9.1软件,构建“关键靶点-核心成分-关键通路”网络图。

1.7 分子对接验证在TCMSP数据库下载山楂叶核心成分的3D结构,未被TCMSP收录的化合物从PubChem数据库中获取SDF文件,并通过Open Babel3.1.1转化成MOL2格式。使用AutoDockTools 1.5.7对化合物进行加全氢,分配电荷,设置扭转键处理,从而构建小分子配体库。从PDB数据库(https://www.rcsb.org/)下载山楂叶抗T2DM的关键靶点的3D结构,将其导入PyMol软件,去除水分子、溶剂和原配体,在AutoDockTools 1.5.7设置为受体,构建受体蛋白库。采用AutoDock 4.2.6将受体蛋白和小分子配体进行半柔性对接,采用PyMol进行可视化展示。

1.8 交集靶点的组织分布及细胞内表达情况将山楂叶和T2DM的交集靶点导入BioGPS数据库(http://biogps.org/#goto=welcome),筛选出表达量大于中位值和2倍中位值的糖尿病相关组织,通过Cytoscape 3.9.1构建靶点-组织分布网络。将筛选出的关键组织所对应的基因逐个输入到The Human Protein Atlas数据库(https://www.proteinatlas.org/)中,整理分析其在关键组织的不同类型细胞中的表达情况。

2 结果

2.1 山楂叶活性成分及潜在靶点通过文献收集、数据库整理及SwissADME筛选,得到山楂叶化学成分130个,其中牡荆素、熊果酸和谷甾醇的胃肠道吸收“GI absorption=low”,但这三种化合物是山楂叶的重要成分且具有糖苷酶抑制作用[7-9],因此,将其纳入研究范围。通过Swiss Target Prediction数据库预测得到622个山楂叶化学成分的潜在靶点,除去数据库无法预测到靶点的成分及靶点概率“Probability<0.1”的成分,最终确定了92个活性成分,包括有机酸25个、维生素4个、氨基酸及含氮化合物13个、萜类12个、苯丙素类11个、黄酮类15个、其他醛酮酯类化合物及糖苷12个。

2.2 T2DM相关靶点及山楂叶抗T2DM潜在靶点利用DrugBank、TTD、GeneCards、CTD和OMIM数据库检索并去除重复文献整理得到T2DM相关靶点2 033个。利用Venny 2.1.0绘制山楂叶潜在靶点和T2DM相关靶点的韦恩图,得到306个交集靶点,将其作为山楂叶治疗T2DM的潜在靶点,见图1。

2.3 PPI网络及山楂叶抗T2DM关键靶点将山楂叶抗T2DM的潜在靶点上传至STRING平台,设置物种为“Homo sapiens”且最低相互作用阈值为0.4,去除游离靶点,得到PPI网络图。将该图导入Cytoscape 3.9.1软件,根据“Betweenness”“Closeness”“Degree”值进一步筛选得到16个靶点,将其作为山楂叶抗T2DM的关键靶点。最终的关键靶点网络图中共有16个节点和117条边,平均相邻节点14.625,节点大小代表度值(Degree)大小。山楂叶治疗T2DM的关键靶点筛选流程见图2,关键靶点信息见表1。

图1 山楂叶潜在靶点与T2DM相关靶点韦恩图

图2 山楂叶治疗T2DM的关键靶点筛选流程图

表1 山楂叶治疗T2DM的关键靶点信息

2.4 活性成分-交集靶点网络及核心成分将山楂叶活性成分和山楂叶-T2DM交集靶点导入Cytoscape 3.9.1软件,根据“Betweenness”“Closeness”“Degree”值筛选得到28个核心成分,根据度值排序,节点度值越高的成分成为山楂叶抗T2DM关键成分的可能性越大,见表2。其中,黄酮类成分占46.4%,三萜占21.4%,有机酸占14.2%,苯丙素类占10.7%,酮及糖苷占7.3%。利用Cytoscape 3.9.1绘制活性成分-交集靶点网络图,见图3。

2.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析通过DAVID6.8数据库进行GO和KEGG富集分析,以P<0.05为标准筛选条目。结果显示,GO功能富集分析得到835条生物学过程(biological process,BP),110条细胞组成(cellular component,CC)和213条分子功能(melucular function,MF),根据P值进行升序排序,排名前10位的条目,见图4。其中,BP过程主要涉及对药物的反应、凋亡过程的负调控、MAP激酶活性的正向调节、肽基酪氨酸磷酸化及蛋白质自磷酸化等。CC条目主要包括质膜、膜筏、受体复合物及胞质溶胶等。MF条目主要包括相同的蛋白质结合、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性、血红素结合及ATP结合等。KEGG富集分析共得到170条通路,根据P值升序排序的前30条KEGG通路中,血糖调节相关通路包括HIF-1信号通路、AGE-RAGE信号通路在糖尿病并发症中的作用、PI3K-Akt信号通路、FoxO信号通路、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)信号通路、胰岛素抵抗、胰岛素信号通路、Rap1信号通路、Prolactin信号通路,将其作为山楂叶抗T2DM的关键通路,见图5。经PPI筛选出的16个关键靶点中,14个靶点富集到了上述关键通路上,对应于27个核心成分,最后利用Cytoscape3.9.1软件绘制“关键靶点-核心成分-关键通路”网络图,见图6。

表2 山楂叶治疗T2DM的核心成分信息

图3 活性成分-交集靶点网络图

图4 功能富集分析图

2.6 关键靶点与核心成分的分子对接结果将14个关键靶点作为受体蛋白,与对应的27个核心成分进行分子对接,结果如表3所示。一般结合能小于-1.2 kcal·mol-1或者小于-5 kJ·mol-1被认为具有良好的结合活性,本研究的对接结果均满足该条件。其中,山柰酚与AKT1、EGFR,常春藤素与IL-6,山楂酸与MAPK3,β-脱水淫羊藿与mTOR,柚皮素与SRC、VEGFA,(5E,9E)-法尼基丙酮与STAT3均具有较强的结合能力。以常春藤素、柚皮素、山柰酚为例,采用PyMol软件将其与受体蛋白的结合情况进行可视化展示,见图7。

图5 KEGG通路富集分析图

图6 “关键靶点-核心成分-关键通路”网络图

表3 活性成分与关键靶点的分子对接

续表3 活性成分与关键靶点的分子对接

注:A:常春藤素和IL-6;B:柚皮素和SRC;C:山柰酚和EGFR。图7 部分分子对接结果可视化展示

2.7 交集靶点在组织器官及细胞内分布情况通过BioGPS数据库分析交集基因在组织中的分布情况,见表4。由大于中位值结果可知,富集基因数量排名前6的组织分别是甲状腺、垂体、肝脏、心脏、胰岛和肺;由大于2倍中位值结果可知,富集基因数量排名前6的组织分别是肺、全血、肝脏、结肠、甲状腺和心脏。将大于中位值和2倍中位值结果中富集基因数量均排名前6的组织作为关键组织,包括肝脏、甲状腺、心脏和肺,说明基因在这些组织中具有高表达情况。通过Cytoscape 3.9.1将2倍中位值结果中的200个基因与11个组织构建交集基因-组织分布网络,见图8。通过The Human Protein Atlas数据库分析上述200个基因在关键组织的不同细胞中的表达情况,结果显示在甲状腺中,基因主要分布于甲状腺腺细胞;在肝脏和肺部中,基因主要分布于肝细胞和肺泡细胞;在心脏中,基因主要分布于平滑肌细胞、巨噬细胞和浆细胞;在胰腺中,基因主要分布于内皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞和导管细胞中,见图9。

图8 交集基因-组织分布网络图

图9 交集基因在不同细胞中的表达情况

表4 交集基因的组织分布情况

3 讨论

本研究挖掘了山楂叶治疗T2DM的活性成分,度值排名在前的包括α-亚麻酸、白杨素、芹菜素、柚皮素等。α-亚麻酸是一种脂肪酸,可改善小鼠血糖水平、葡萄糖耐量和胰岛素抵抗指数[10],高剂量α-亚麻酸还可以改善肝脏组织炎症。Canetti等[11]发现α-亚麻酸可通过减少胰腺损伤,降低血糖和胰岛素水平,进而改善链脲佐菌素诱导的小鼠糖尿病。山楂叶提取物的降血糖活性与总黄酮含量呈正相关,说明黄酮类成分是影响其活性的主要因素[12]。芹菜素又称芹黄素,是山楂叶总黄酮中的重要化合物之一。研究表明,二肽基肽酶Ⅳ会阻断肠促胰岛素的促胰岛素分泌作用,导致胰岛受到影响无法降低血糖,而芹菜素对二肽基肽酶Ⅳ具有抑制作用,从而降低血糖[13]。芹菜素还是良好的α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制剂,且抑制能力与广泛使用的抑制剂阿卡波糖相当[14]。Wang等[15]合成了芹菜素和白杨素一氧化氮供体衍生物,经体外评估后发现,该合成物具有比常见抑制剂阿卡波糖和1-脱氧野尻霉素更高的α-葡萄糖苷酶抑制能力。芹菜素在糖尿病并发症方面也有良好作用,刘俊法[16]发现芹菜素能够呈剂量依赖性地有效降低链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠血糖水平,减轻肝细胞损伤,对肝功能有改善和保护作用。此外,柚皮素可以显著降低胰岛素抵抗指数水平,改善糖耐量受损,提高超氧化物歧化酶活性[17]。

KEGG富集分析结果显示,山楂叶治疗T2DM的血糖调节相关通路有PI3K-Akt信号通路、胰岛素抵抗、胰岛素信号通路、HIF-1信号通路、FoxO信号通路、VEGF信号通路等。文献报道表明,上述通路与胰岛素信号传导和炎症因子转录有密切关系,因此,山楂叶可能通过胰岛素信号传导和炎症反应两个方面调控血糖。山楂叶活性成分可能通过启动胰岛素调控下的PI3K-Akt信号通路来激活胰岛素信号通路及其他生物过程,如调节肝脏和肌肉中的糖异生,增加胰腺的胰岛素分泌等[18]。胰岛素和细胞膜外胰岛素受体(insulin receptor,IR)结合,吸引胰岛素受体底物和IR结合,胰岛素信号由此传导到细胞内,最终激活PI3K-Akt信号通路,而被激活的AKT可磷酸化各种底物如糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)、叉头框蛋白O1(forkhead boxprotein O1,FoxO1)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)等[19]。抑制GSK-3β可保护糖尿病大鼠肝脏,降低血糖水平,且其对葡萄糖稳态的积极作用与二甲双胍相当[20]。FoxO1的乙酰化促进糖异生相关基因表达,去乙酰化促进对胰岛β细胞有重要作用的基因表达[21]。mTOR的两种复合物mTORC1和mTORC2分别调控着胰岛细胞的正常功能和肝脏糖脂代谢[22-23]。PI3K-Akt通路激活还可以促进缺氧诱导因子-1(hypoxia-inducible faftor-1,HIF-1)产生,诱导肝葡萄糖激酶表达[24],进而激活VEGF信号通路和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)等糖酵解途径中的关键酶[25]。另一方面,山楂叶活性成分可能通过胰岛素抵抗通路调控炎症因子,进而改善血糖水平。在胰岛素抵抗通路中,高血糖状态会激活肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF),从而启动核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)蛋白,NF-κB进一步启动炎症因子IL-6和TNF的转录。T2DM中炎症因子会转变为促炎因子,干扰外周组织胰岛素信号传导或诱导β细胞功能障碍,最终导致胰岛素缺乏[26]。由此可知,炎症因子对于调节胰岛素和血糖水平具有重要作用。研究发现,在T2DM患者的血清中IL-6水平升高[27],因此IL-6与T2DM有密切关系。IL-6的两种转导方式即经典受体信号转导和反式信号转导都与血糖关系密切,前者控制着葡萄糖代谢和神经内分泌系统的调节,后者可通过结合受体来激活炎症信号转导途径[28]。不仅如此,IL-6可通过部分抵消胰岛素抵抗和巨噬细胞转变,从而缓解炎症[29]。短期抗TNF-α mAb治疗可防止胰岛β细胞破坏,恢复胰岛素敏感性和正常血糖水平[30]。因此,山楂叶活性成分可能通过调控 IL-6 和TNF缓解炎症从而降低血糖。另外,山楂叶不仅可以防治糖尿病及其并发症[31-32],而且能够诱导癌细胞凋亡[33],KEGG富集分析的前30条通路中关于癌症的条目也较多,因此山楂叶抗T2DM具有巨大的治疗潜能和开发价值。

肝脏通过糖异生和糖原合成来维持血糖平衡,肝细胞占肝脏体积的80%,负责大部分的代谢过程,因此肝细胞功能失调会产生一系列负面影响。组织分布结果显示,肝脏在两种中位值筛选中均排名前3,说明交集基因在肝脏中具有高表达情况。山楂叶核心成分(如α-亚麻酸、芹菜素等)对肝细胞有保护作用,且T2DM炎症部位也聚集在肝脏,加之关键通路(如PI3K-Akt信号通路)及关键靶点(如IL-6、TNF、HIF-1α等)在肝脏治疗中也展现了良好效果,因此,肝脏可能是山楂叶调控血糖的关键组织之一。

本文基于网络药理学和分子对接技术预测了山楂叶治疗T2DM的活性成分、潜在靶点、关键通路及生物学功能,初步探讨了山楂叶通过多成分、多靶点、多通路、多组织等途径调节血糖的作用机制,但本研究结论仍有待通过药理学实验进一步验证。