房慧琴,王佳宁,刘永吉,刘泳,赵军绩,臧运华

1.山东中医药大学,山东 济南 250014; 2.青岛大学附属青岛市海慈医院,青岛市中医医院,山东 青岛 266033

动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是一种慢性炎症性疾病,AS斑块的形成与不同细胞因子和脂质介质驱动的免疫反应以及影响内皮细胞的局部血流动力学等有关[1]。不稳定的AS斑块破裂、血管狭窄或血小板凝聚及栓塞所导致的闭塞都可能会引起严重的心脑血管疾病[2]。血栓形成叠加在破裂或侵蚀的AS斑块上易导致各种心脑血管疾病[3-4],如冠心病、脑梗死等。目前,西医治疗AS的方法有手术治疗、药物治疗等,而中医治疗AS具有一定的优势和特色,但其具体作用机制不明确,仍需继续探讨。

营卫学说来源于《黄帝内经》,在中医理论上占有举足轻重的地位。“营卫”的生成和运行,与血液和脉络有关。营属阴卫属阳,营气由水谷之精气化生,入于脉中,循脉运行全身,终而复始,营周不休。经络是营卫之气运行的通道,气血是营卫之气的载体,营卫之气依赖于脏腑的生理功能,脏腑的生理功能又依赖于营卫之气的充养。卫气,水谷之悍气,运行于脉外,具有防御外表、濡养全身和调理全身腠理的作用。调和营卫法的代表方剂桂枝汤,最早见于《伤寒论》,由桂枝、白芍、生姜、甘草、大枣组成,已有研究表明,桂枝汤治疗AS疾病有很好的效果[5-7],但作用靶点及机制尚未系统研究。本文选用网络药理学方法[8]对桂枝汤活性成分和AS疾病相关靶点进行筛选及预测分析,并用分子对接技术验证筛选出的有效活性成分与作用靶点之间的结合情况,探究桂枝汤治疗AS的作用机制。

1 资料与方法

1.1 桂枝汤的活性成分及其相关靶点预测和桂枝汤“活性成分-作用靶点”网络的构建通过中药系统药理学数据库与分析平台 (traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP,http://www.tcmsp.com/tcmsp.php)[9]分别检索“桂枝”“白芍”“甘草”“生姜”“大枣”这5味药物的化学成分,以口服生物利用度 (oral bioavailability,OB) ≥30%、类药性指数 (drug-likeness,DL) ≥0.18[10]为条件筛选活性成分,并检索活性成分的相关靶点。通过Uniprot数据库 (https://www.uniprot.org) 实现靶点的规范化,设置物种为Homo spanies(智人)、reviewed(已审核),获得桂枝汤的活性成分及靶点。通过Cytoscape 3.9.1[11]构建“桂枝汤-活性成分-作用靶点”网络,并进行拓扑分析,通过对其节点的度中心性(degree centrality,DC)、中介中心性(betweenness centrality,BC)和接近中心性(closeness centrality,CC)进行计算,筛选出桂枝汤治疗AS的关键活性成分。

1.2 AS相关靶点的搜集及桂枝汤治疗AS的潜在靶点的获取通过GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)[12]、DisGeNET数据库(https://www.disgenet.org/search/)[13]和DRUGBANK数据库(https://www.drugbank.ca/)[14]搜索“Atherosclerosis”,分别获取AS的靶点,整合去重后获得AS的相关靶点。将中药活性成分相关靶点与疾病靶点导入Venny 2.1.0 (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/),获取交集靶点,即为桂枝汤治疗AS的潜在靶点。

1.3 蛋白质互作 (protein-protein interaction,PPI) 网络构建与分析将桂枝汤治疗AS的潜在靶点导入STRING 11.0数据库(https://string-db.org/cgi/input.pl)中,将生物类型设为“Homo sapiens”,最低要求的交互分数>0.7高置信度,且隐藏游离节点,构建PPI网络。运用Cytoscape 3.9.1软件对网络进行拓扑分析,以DC、BC、CC中位数的2倍为条件重复筛选两次,获得核心靶点。

1.4 富集分析及“核心靶点-信号通路”网络图构建使用R软件对潜在靶点进行基因本体(gene ontology,GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信号通路富集分析,并绘制出气泡图,进一步阐明桂枝汤治疗AS的作用机制。使用Cytoscape 3.9.1软件研究桂枝汤治疗AS的核心靶点与通路之间的关系,构建 “核心靶点-信号通路”网络图,拓扑分析筛选核心信号通路及关键靶点。

1.5 分子对接从PDB数据库(https://www.rcsb.org/)获取核心靶点的蛋白结构,利用PyMol 2.4.0执行“remove solvent” “remove organic”命令,并将其导入到AutoDockTools-1.5.6中加氢保存,再从Pubchem数据库系统(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中获取活性成分的2D结构。利用AutoDock_Vina软件进行分子对接模拟,并根据结合能评估最终对接结构,将其导入到PyMol2.4.0中进行可视化分析。

2 结果

2.1 桂枝汤的有效成分、相关靶点及桂枝汤“活性成分-作用靶点”网络基于TCMSP检索“桂枝”“白芍”“甘草”“生姜”“大枣”这5味药物的化学成分,以OB≥30%、DL≥0.18为条件进行筛选,共得到桂枝汤146种活性成分,并检索到活性成分的相关靶点2 476个,整合去重后得到240个靶点。活性成分及相关靶点的分布信息见表1。通过Cytoscape 3.9.1构建桂枝汤“活性成分-作用靶点”网络,如图1所示,分别用不同形状、颜色代表中药成分及靶点,其中菱形为靶点,六边形为药物有效成分。图中共包含281个节点和671条边。网络拓扑分析筛选得到槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、豆甾醇、β-胡萝卜素等为桂枝汤治疗AS的关键活性成分,见表2。

表1 桂枝汤组方中药活性成分及靶点分布信息表

注:BS:白芍;GZ:桂枝;GC:甘草;SJ:生姜;DZ:大枣;A1:白芍、桂枝、大枣、生姜的共有成分;B2:白芍、桂枝、大枣的共有成分;C3:白芍、甘草的共有成分;D1:大枣、生姜的共有成分;D2、D3:大枣、甘草的共有成分;E1:桂枝、甘草的共有成分。图1 桂枝汤“活性成分-作用靶点”网络图

表2 中药关键活性成分相关参数表

2.2 AS相关靶点及桂枝汤治疗AS的潜在靶点通过GeneCards、DisGeNET、DRUGBANK数据库筛选出AS的相关靶点,将三个数据库数据汇总后去除重复值共得到333个AS相关靶点。将桂枝汤活性成分相关靶点与AS相关靶点导入Venny 2.1.0制作成韦恩图,获得交集靶点62个,即桂枝汤治疗AS有62个潜在靶点,见图2。

图2 桂枝汤活性成分相关靶点与AS靶点韦恩图

2.3 PPI网络将桂枝汤治疗AS的潜在靶点导入到STRING 11.0数据库中,将生物类型设为“Homo sapiens”,最低要求的交互分数>0.7高置信度,隐藏游离节点,构建PPI网络,见图3。该PPI网络共有127个节点和547条边。运用 Cytoscape 3.9.1软件分析桂枝汤活性成分与AS靶点之间的相互作用,利用Cytohubba插件根据网络中节点的DC、BC、CC值得到9个核心靶点,见表3、图4。

2.4 GO富集分析GO富集分析共获得1 595个条目,其中分子功能(molecular function,MF)91个条目,细胞组分(cellular component,CC)31个条目,生物学过程(biological process,BP)1 473个条目,根据“p value Filter=0.05,q value Filter=0.05”条件进行筛选,并对每个条目的前10位结果做柱状图表示,横坐标代表基因组数目,纵坐标代表具体的GO 条目,颜色代表GO富集的显著性,颜色越红代表基因富集越明显,见图5。分析显示,BP包括对脂多糖的反应(response to lipopolysaccharide)、对细菌来源分子的反应(response to molecule of bacterial origin)、对氧化应激的反应(response to oxidative stres)、对缺氧的反应(response to hypoxia)、对外源性刺激的反应(response to xenobiotic stimulus)、对肽的反应(response to peptide)等;CC主要涉及膜筏(membrane raft)、膜微区(membrane microdomain)、囊泡腔(vesicle lumen)、肽酶抑制剂复合物(peptidase inhibitor complexe)、丝氨酸型肽酶复合物(serine-type peptidase complexe)、分泌颗粒腔(secretory granule lumen)等;MF主要涉及过氧化物酶活性(peroxidase activity)、氧化还原酶的活性,作用于过氧化物作为受体(oxidoreductase activity,acting on peroxides as receptors,cytokine activity)、细胞因子活性(cytokine activity)、抗氧化活性(antioxidant activity)、蛋白酶结合(protease binding)等。

图3 PPI网络

表3 核心靶点相关信息

图4 核心靶点筛选过程相关靶点PPI网络

图5 桂枝汤治疗AS潜在靶点GO富集分析

2.5 KEGG信号通路富集分析KEGG富集分析共得到119条通路,并根据“p value Cutoff =1,q value Cutoff =1”条件进行筛选,对其前30条富集分析结果进行气泡图展示,见图6。KEGG富集分析结果显示,核心靶点主要与以下几类有关,如与脂质和动脉粥样硬化(lipid and atherosclerosis)、流体剪切应力和动脉粥样硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)、癌症中的蛋白多糖(proteoglycans in cancer)、人巨细胞病毒感染(human cytomegalovirus infection)、癌症中的转录失调(transcriptional misregulation in cancer)、非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver disease)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、酒精性肝疾病(alcoholic liver disease)等有关;与传染性疾病相关,如美洲锥虫病(chagas disease)、变形虫病(amoebiasis)、乙型肝炎(hepatitis B)、疟疾(malaria)、弓形体病(toxoplasmosis)、丙型肝炎(hepatitis C)、甲型H1N1流感(influenza A)、百日咳(pertussis)、非洲锥虫病(African trypanosomiasis)、军团杆菌病(legionellosis)等;与癌症相关,如前列腺癌(prostate cancer)、膀胱癌(bladder cancer)、小细胞肺癌(small cell lung cancer)、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染(Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)等;以及与信号通路有关,如糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、TNF信号通路(TNF signaling pathway)、IL-17信号通路(IL-17 signaling pathway)、C-型凝集素受体信号通路(C-type lectin receptor signaling pathway)、NF-κB信号通路(NF-kappa B signaling pathway)、Toll样受体信号通路(Toll-like receptor signaling pathway)、松弛素信号通路(relaxin signaling pathway)等。以上结果表明,桂枝汤可通过多条信号通路参与治疗动脉粥样硬化,见图6。

图6 潜在靶点KEGG富集分析气泡图

2.6 “核心靶点-信号通路”网络对桂枝汤治疗AS核心靶点与通路之间的关系进行可视化分析,得到“核心靶点-信号通路”网络,由图可知,节点上自由度最大的通路为脂质和动脉粥样硬化,而自由度最大的靶点是肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6),提示该通路与该靶点可能在桂枝汤治疗AS过程中起到关键作用,见图7。

2.7 分子对接分子对接结果表明,槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚等为与核心靶点结合活性较高的活性成分;而基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase 9,MMP-9)、前列腺素内过氧化物合成酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,PTGS2)、细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)等是活性成分作用较好的核心靶点。小分子配体与蛋白受体结合能越低,结合分子之间稳定性越高,提示分子之间发生相互作用的可能性越大,核心成分与核心靶点的结合能见表4。图8展示对接结果较好的8组,其中以MMP-9、PTGS2、ICAM1与其对应的化合物结合更稳定。槲皮素与MMP-9结合能最低,其结合能为-10.7 kcal·mol-1,推测其可能是潜在靶点抑制剂,且其潜在的结合位点有LEU-243、GLN-227、ALA-189氨基酸残基,与之形成氢键,氢键距离依次是2.7Å、2.3Å、2.0Å、2.4Å,随着氢键距离的缩短,其结合亲和力则会越强;斯特法林、(-)-二氢槲皮素、左旋山槐素、β-谷甾醇与PTGS2有良好的结合力,结合力强弱大小依次是:左旋山槐素>(-)-二氢槲皮素>β-谷甾醇>斯特法林。槲皮素与ICAM-1的潜在结合位点是SER-176氨基酸残基,二氢槲皮素与ICAM-1的潜在结合位点THR-300、LYS-360氨基酸残基,山柰酚与ICAM-1的潜在结合位点是HIS-201、MET-202、SER-176氨基酸残基,3种化合物与氨基酸残基形成氢键的平均距离为2.3Å,证实3种物质能够与靶点蛋白稳定地结合。

注:外圈红色菱形为信号通路;内圈长方形为核心靶点。图7 “核心靶点-信号通路”网络图

表4 分子对接结果

图8 桂枝汤治疗AS的核心靶点与活性成分的分子对接模式图

3 讨论

AS属中医学“胸痹”“中风”“脉痹”等范畴,以本虚标实为主,常以益气活血法治疗,其作为心脑血管病变的主要病理基础,动脉内膜处于关键地位,受累动脉病变从内膜开始,先后出现多种病变,包括脂质条纹、纤维斑块和粥样斑块。近年来,AS“由外向内”的发病机制成了新的研究热点[15]。血管外膜含有多种具有免疫调节功能的细胞,如成纤维细胞、巨噬细胞、滋养血管(vasa vasorum,VV)等,在血管应激或受损时,外膜细胞通常最先被活化,参与调节血管张力并重塑血管的结构。有研究表明,在高胆固醇饮食喂养的猪的冠状动脉中,外源性VV密度的显著增加先于内皮功能障碍[16]。因此,对于AS的治疗需要注意内外膜的保护。

营卫学说中,脉是营卫运行的通道,《灵枢·营卫生会》记载:“营行脉内,卫行脉外,营周不休。”营卫是由水谷精微所化,其运行及功能均与脉息息相关。若营卫功能失衡则气血运行阻滞,造成血液凝滞不通。《伤寒论·辨脉法》云“荣卫不通,血凝不流”。孙络亦与营卫运行不畅相关,张景岳曰:“表里之气,由络以通,故以通营卫。”孙络是营卫之气交会之处。而孙络病变与微血管的功能异常也有极大的相似性,应将外膜微血管归于孙络范畴。营卫以气血的形式存在,营卫相和运行促进脉络中血液通畅;营卫不和致痰瘀阻络,与AS病理过程中的高脂血症及血液高凝有关。无论从中医还是西医上,营卫失调,都是AS形成的重要原因,而桂枝汤作为调和营卫的基本代表方,也从侧面验证了调和营卫法可以治疗AS。

本研究表明,在桂枝汤活性成分中Degree排前3名的依次是槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚。槲皮素在对抗AS中有内皮细胞保护作用、脂质代谢调节、抗炎活性、抗细胞凋亡等作用[17];槲皮素还可通过升高一氧化氮(nitric oxide,NO)合成酶水平来阻止AS斑块的形成[18],降低基质金属蛋白酶1 (matrix metalloproteinase 1,MMP-1) 来稳定内皮AS斑块[19]等。β-谷甾醇具有抗炎、抗氧化、降脂、抑制癌症发展等作用[20]。Koo等[21]用β-谷甾醇防治载脂蛋白E缺乏症小鼠的AS,并通过抑制巨噬细胞NO和活性氧(reactive oxygen species,ROS)所产生的诱导型一氧化氮合成酶表达改变黏附分子的表达,从而降低血管增厚及血浆总胆固醇、氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)和C反应蛋白水平,进而降低AS病变程度。山柰酚具有良好的抗氧化效果,可以清除超氧阴离子、羟基自由基,并抑制活性氧酶的活性等[22],并且山柰酚可降低大鼠高脂饮食中的脂质含量,通过调节OPN-CD44通路来减轻AS症状[23]。

PPI蛋白互作网络分析得到9个核心靶点,分别为TNF、IL-6、IL-1β、IL-10、CXCL8、MMP-9、VEGFA、ICAM-1、PTGS2,TNF、IL-6是Degree值较高的两个靶点。在分子对接中,MMP-9结合能最低,结合力最强,TNF、IL-6、MMP-9这3个靶点可能在桂枝汤治疗AS中起到关键作用。TNF-α能够促使LDL向ox-LDL的转移,激活单核细胞因子,促进细胞激素的正常释放;IL-6还可以直接促使外周血T细胞增殖和辅助性B型细胞的分化生长,并能使外周血中性粒细胞迅速向周围血管内膜渗透,从而参与AS形成[24];衰老可引起线粒体功能下降和线粒体自噬破坏,与升主动脉中的炎性细胞因子 IL-6 水平的大幅上升有关;同时 IL-6 也可与受损细胞中的血管线粒体功能水平发生关联,从而导致AS斑块的形成[25]。在小鼠实验中,IL-1β 并不能使病变形成,但在高胆固醇喂养的实验中,外源性IL-1β可使内膜的中层加厚[26]。NLRP3炎性小体激活了IL-1β,使其能够驱动 IL-6 信号通路,这也是AS血栓形成的另一种可能因素[27]。基质金属蛋白酶则能够调节AS中的各种细胞和信号通路,从而促使AS斑块的生成和破坏[28]。MMP-9是稳定型冠心病病人AS斑块不稳定的最强独立预测因子,其水平与冠状AS斑块坏死核心的大小呈正相关[29]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)家族是控制血液和淋巴管的调节因子,VEGF-A与VEGFR-1、VEGFR-2一起调控血管形成、血管渗透性和炎症反应。VEGF-A是组织血运重建过程中形成血管过程的核心,研究表明,在 ST段抬高型心肌梗死期间,VEGF-A 水平与微血管闭塞独立相关,且与中期左心室射血分数相关[30]。ICAM-1促进白细胞与内皮细胞之间的相互黏附,进而引起免疫和炎症反应,在AS病变中ICAM-1的作用尤为关键,可促使单核细胞迁入内皮,摄取脂质转化为泡沫细胞,从而形成AS斑块[31]。IL-10调控巨噬细胞活化及脂质负载和活化的泡沫细胞中的MMP、促炎性细胞因子和环氧合酶-2的表达[32]。在AS病变中,巨噬细胞可以产生新的IL-10,参与调节巨噬细胞和T细胞的局部炎症反应,减轻病变部位炎症程度,减缓AS的进程[33]。在泡沫细胞生成之前的局部炎症阶段PTGS2下调,且PTGS2在巨噬细胞中的表达对低密度脂蛋白受体 (low density lipoprotein receptor,LDLR) 缺陷小鼠AS病变的形成有一定的促进作用[34]。上述靶点在调控细胞因子、炎症反应、增强免疫、脂质代谢等方面起到了重要作用,同时也证实了桂枝汤在AS的治疗中存在多靶点协同效应。

GO富集分析中,BP多以对脂多糖的反应、对细菌来源的分子的反应、对氧化应激反应等为主。有研究发现肠道内的脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)具有促AS的作用,使用ELISA和免疫组化检测时发现,AS患者血清中的LPS水平显著升高,颈动脉斑块组织切片LPS呈阳性[35]。CC多以膜筏、膜微区等为主,膜筏主要与介导和扩增各种细胞信号有关,并参与细胞吞噬、生长、迁移等多种生理过程。膜筏中的胆固醇动态组装可能是内皮细胞对损伤因素作出反应的重要机制,膜筏中的胆固醇聚集会引发一系列信号通路,导致内皮细胞损伤和炎症反应,继而导致AS等形成[36-37]。MF中多以受体配体活性、细胞因子受体结合、细胞因子活性等为主,参与AS过程的细胞产生并被可溶性因子所活化,且有研究指出促炎细胞因子和抗炎细胞因子失调可能会是AS发展的原因之一[38]。

KEGG富集分析核心通路中,以脂质与动脉粥样硬化通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化、TNF信号通路、NF-κB信号通路等为主。流体剪切应力可以导致巨噬细胞的数量增多,影响单核巨噬细胞的募集,维持炎症反应,影响巨噬细胞的吞噬作用和细胞极化等,参与AS过程[39]。AGE与RAGE相互作用产生的ROS可激活NF-κB,从而激活如TNF-α、IL-6等促炎因子。ROS本身也能促使ICAM-1、VCAM-1的表达,进而增强AS发生所需的生物分子的表达[40]。NF-κB信号通路主要是对TNF-α、IL-1和IL-18等促炎性细胞因子作出应答,Kanters等[41]使用IKK2缺失的LDLR缺陷小鼠研究发现,抑制巨噬细胞中NF-κB通路活化可导致小鼠AS病变更加严重。这一结果与抗炎和抗AS细胞因子IL-10的显著减少密切相关,表明一定水平的NF-κB激活对控制炎症反应和抵消原AS过程是必要的。

本研究表明桂枝汤的核心有效成分槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、豆甾醇等通过对脂多糖反应、对氧化应激反应、对缺氧反应等过程的调控作用启动AGE-RAGE信号通路、脂质与动脉粥样硬化通路、流体剪切力和动脉粥样硬化、TNF信号通路、NF-κB信号通路等发挥对AS的改善作用,体现出桂枝汤从多通道多角度治疗AS的特点,同时也从分子机制上论证了调和营卫法确实能够治疗AS,为后续通过调和营卫法治疗AS提供依据。