姚梦玮，李玉迁，徐庆胜，方小菡，魏洪，迟茜文，刘蕊

1.贵州医科大学基础医学国家级实验教学中心，贵州 贵阳 550025；2.贵州省普通高校学校病原生物学特色重点实验室，贵州 贵阳 550025；3.贵州省人民医院病理科，贵州 贵阳 550002；4.贵州中医药大学第二附属医院红岩院区中心实验室，贵州 贵阳 550003

2020年，女性乳腺癌已超过肺癌，成为最常见的癌症，新发病例数达2 261 419例，占总体癌症发病的11.7%［1］。其中三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）占乳腺癌的15% ~ 20%［2］，由于缺乏雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）和表皮生长因子受体2（epidermal growth factor receptor 2，HER2）的表达，与其他乳腺癌相比，其恶性等级高、转移和侵袭性强、预后差［3］。研究报道，乳腺癌的发生发展、转移、耐药等特性与上皮-间质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）进程密切相关［4］。目前，TNBC 的主要治疗手段是手术切除联合化疗［5］，但其高转移性及耐药性的发生使疗效不佳。

溶瘤病毒疗法是一类新兴的抗肿瘤治疗方法，其能利用肿瘤细胞中抑癌基因失活或缺陷的特点，选择性杀伤肿瘤细胞而不影响正常细胞。麻疹病毒（measles virus，MV）为生物疗法应用广泛的溶瘤病毒，MV-Edm、MeV-SCD 等麻疹株已被证实具有抑制乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231、4T1 等细胞株增殖的作用［6-7］。其中麻疹减毒活疫苗Hu191（MV-Hu191）株制备的疫苗在我国广泛应用于预防MV 感染近50年［8］，是一种有效安全的生物制剂［9］。自2012 年开始，先后报道了MV-Hu191 对胃癌［10］、结肠癌［11］、肾母细胞癌［12］等细胞株具有抑制其增殖及迁移能力，但未见MV-Hu191 株治疗乳腺癌的相关报道。本研究通过体内外试验检测MV-Hu191 对TNBC 4T1 细胞EMT、增殖及迁移的影响，为治疗TNBC 提供一种新的生物治疗思路。

1 材料与方法

1.1 病毒及细胞株 MV-Hu191 株和Vero 细胞由贵州省疾病预防控制中心惠赠；鼠TNBC 细胞株4T1由贵州医科大学附属医院临床研究中心惠赠。

1.2 实验动物 30只SPF级BALB／c小鼠，雌性，5~6周龄，体质量（18 ± 2）g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK（京）2019-0008。饲养温度为22 ~ 25 ℃，湿度为50% ~ 80%，昼夜交替12 h 饲养。本实验经贵州医科大学伦理委员会审核批准（2200011）。

1.3 主要试剂及仪器 胎牛血清和10×青霉素链霉素购自以色列BI公司；高糖DMEM和胰蛋白酶EDTA购自美国Gibco 公司；紫杉醇（纯度>98%）购自上海麦克林生化科技有限公司；CCK-8购自美国APExBIO公司；HE 染色试剂盒、琼脂糖、高效RIPA 组织／细胞裂解液、结晶紫和SDS-PAGE 凝胶超快速配置试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；4%多聚甲醛溶液购自北京雷根生物技术有限公司；单克隆Anti-Ecadherin Rabbit pAb 购自美国Bioworld 公司；单克隆Anti-GAPDH Mouse pAb 购自美国Abcam 公司；多克隆Anti-MMP-2 Rabbit pAb 购自武汉三鹰生物技术有限公司；多克隆Anti-MMP-9 Rabbit pAb购自美国SAB公司；Anti-Rabbit IgG 二抗购自美国Proteintech 公司；超特敏ECL 化学发光试剂盒购自德国Millipore公司；免疫组化染色试剂盒购自北京博奥森生物技术公司；酶标仪购自美国Bio Tek 公司；多功能凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司。

1.4 细胞培养及病毒扩增 用含10%胎牛血清、10×青链霉素的DMEM培养基，于37 ℃，5%CO2培养箱中培养4T1和Vero细胞。按3.0 g／L CCID50MV-Hu191感染Vero 细胞，1 周后收集病毒，采用聚乙二醇法浓缩，离心后弃上清，用无血清DMEM 重悬沉淀，分装后置-80 ℃冰箱保存。采用Reed-Muench 法计算病毒滴度（TCID50）。

1.5 MV-Hu191对4T1细胞增殖影响的检测

1.5.1 CCK-8 试验 将对数生长期的4T1 细胞按1×104个／mL接种于96孔板，待细胞贴壁后，将细胞分为MV-Hu191处理组（加入MOI分别为1、5、10的MVHu191）和对照组（加入等量培养液），分别培养24、48 和72 h；每孔加入10 μL CCK-8 检测液，孵育2 h，在酶标仪波长490 nm 处检测吸光度值。每组设6 个复孔，计算平均值。

1.5.2 克隆形成试验 将4T1 细胞悬液接种于6 孔板中，5×105个／（孔·1 mL），细胞贴壁后加入不同MOI（1、10）的MV-Hu191，并设对照组（加入等量培养液），孵育2 h；弃去培养液，迅速加入45~50 ℃的2%琼脂糖-10%DMEM 混匀液，每孔3 mL，待凝固后倒置培养3 d；4%多聚甲醛固定2 h；1%结晶紫染色20 min，观察克隆数。

1.6 MV-Hu191对4T1细胞迁移能力影响的检测 采用细胞划痕愈合试验。将4T1 细胞悬液接种于6 孔板中，5×105个／（孔·2 mL），细胞铺满孔底90%时，用枪头垂直与细胞板底部划线，PBS 冲洗脱落细胞，加入不同MOI（1、10）的MV-Hu191，并设对照组（加入等量培养液），分别于培养0、24、48 h 时在倒置显微镜下观察并拍照，利用Image J 软件进行分析，并按下式计算迁移率。

1.7 MV-Hu191 对4T1 细胞EMT 蛋白表达水平影响的检测 采用Western blot法。用MOI=10的MVHu191 处理4T1 细胞48 h，并设对照组（加入等量培养液），收集细胞，加入细胞裂解液混匀，在冰上裂解1 h；4 ℃，12 000×g离心40 min，取上清，BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。取等量蛋白上样，经8%SDS-PAGE 分离后，转移至PVDE 膜上，以5%脱脂奶粉室温封闭2 h；TBST 洗膜3次，加入一抗（MMP-9和MMP-2 均1∶2 000 稀释、E-cadherin 1∶1 000 稀释、GAPDH 1∶10 000稀释），4 ℃孵育过夜；TBST 洗膜3次，加入二抗（1∶5 000稀释），室温孵育1 h；TBST洗膜3次，ECL显色。使用ImageJ软件计算灰度值，以目的基因与内参基因灰度值的比值作为目的基因表达量。

1.8 动物分组及处理 取对数生长期的4T1细胞，调整细胞浓度至1×106个／mL，用脱毛膏脱去小鼠腋下至第2 对乳腺皮肤上的毛发，消毒皮肤，1 mL 注射器刺入小鼠腹壁左侧第2 对乳头皮下，轻轻挑起皮肤，每只注射100 μL 细胞悬液制备肿瘤模型［13］。每隔2 d称量模型小鼠体质量并测量肿瘤长径和宽径，计算肿瘤体积（0.5×长径×宽径2）。将模型小鼠分为对照组（PBS）、MV-Hu191（1×106TCID50）组和紫杉醇组（15 mg／kg），每组10 只。当4T1 荷瘤小鼠肿瘤体积达100~200 mm3时，每2 d瘤内注射药物100 μL，连续给药5次。28 d后麻醉处死小鼠，取肿瘤组织称重，显微镜下计数肺转移结节。

1.9 小鼠肿瘤组织和肺组织病理特征观察 将各组小鼠肿瘤组织和肺组织经4%多聚甲醛固定24 h，包埋，石蜡切片，常规脱蜡至水，按HE染色试剂盒步骤常规染色，显微镜下观察，拍照。

1.10 小鼠肿瘤组织EMT相关蛋白表达的检测 采用免疫组化法。各组小鼠肿瘤组织经4%多聚甲醛固定12~24 h，包埋，石蜡切片，二甲苯脱蜡，EDTA溶液进行抗原修复，3% H2O2去离子水室温孵育20 min；PBS 冲洗3次，加入10%山羊血清，室温封闭20 min；分别加入一抗（MMP-9、MMP-2、E-cadherin 均1∶200稀释），4 ℃湿盒孵育过夜；PBS冲洗3次，加入生物素标记二抗，室温孵育20 min；PBS 冲洗3 次，加入辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温孵育20 min；PBS 冲洗3 次，DAB 显色，显微镜下观察拍照，使用Image J软件进行处理。

1.11 统计学分析 采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。采用Graphpad Prism 8.0软件作图。

2 结果

2.1 病毒滴度 MV-Hu191 感染Vero 细胞扩增后的病毒滴度约为1×106.75TCID50。

2.2 MV-Hu191对4T1细胞增殖的影响

2.2.1 CCK-8试验 MOI=10的MV-Hu191感染4T1细胞后24、48、72 h，细胞活力均显著低于对照组（F分别为5.204、1.732和2.811，P均为0.001）；MOI=1和5 的MV-Hu191 感染4T1 细胞后72 h，细胞活力均显著低于对照组（F分别为12. 944 和4. 467，P分别为0.023和0.001）。见图1。表明MV-Hu191具有抑制4T1细胞增殖的作用，且呈时间剂量依赖性。

图1 感染MV-Hu191后4T1细胞的活力Fig.1 4T1 cell viability after infection with MV-Hu191

2.2.2 克隆形成试验 MV-Hu191感染4T1细胞72 h后的细胞病变效应也呈剂量依赖性，见图2。

图2 MV-Hu191感染4T1细胞的克隆数（×10）Fig.2 Number of 4T1 cell clones infected with MV-Hu191（×10）

2.3 MV-Hu191对4T1细胞迁移能力的影响 MOI=10的MV-Hu191感染4T1细胞后24 h，细胞迁移率显著低于对照组（F=5.609，P=0.042）；MOI=1 和10的MV-Hu191感染4T1细胞48 h后，细胞迁移率均显著低于对照组（F分别为13.619 和13.535，P分别为0.006 和0.002）。见图3 和图4。表明MV-Hu191 具有抑制4T1细胞迁移的作用。

图3 4T1细胞迁移损伤区域（×100）Fig.3 4T1 cell migration to injured area（×100）

图4 细胞迁移面积分析Fig.4 Cell migration area analysis

2.4 MV-Hu191对4T1细胞EMT蛋白表达水平的影响MV-Hu191 感染4T1 细胞48 h 后，与对照组相比，Ecadherin蛋白的表达量显著上调（F=7.001，P=0.032），MMP-2 和MMP-9 蛋白的表达量显著下调（F分别为45.433和9.744，P分别为0.011和0.038），见图5和图6。表明MV-Hu191可抑制4T1细胞EMT的发生。

图5 Western blot 分析MV-Hu191 感染4T1 细胞后EMT蛋白的表达Fig.5 Western blot analysis of EMT protein expression in 4T1 cells infected with MV-Hu191

图6 MV-Hu191感染4T1细胞后EMT蛋白的表达Fig.6 EMT protein expression in 4T1 cells infected with MV-Hu191

2.5 荷瘤小鼠生存期及肿瘤体积的变化 对照组、紫杉醇组和MV-Hu191组小鼠中位生存期分别为24、35和34 d，与对照组相比，MV-Hu191 组显著高于对照组（F=18.079，P=0.000），见图7。与对照组相比，MV-Hu191 组6 ~ 30 d 肿瘤体积增长速度明显放缓（F=8.430，P=0.016），见图8。与对照组相比，MVHu191 组肿瘤质量显著低于对照组（F= 8.301，P=0.003），见图9 和图10。表明MV-Hu191 具有降低4T1荷瘤小鼠肿瘤增殖作用，小鼠生存时间高于对照组，与紫杉醇接近。

图7 4T1荷瘤小鼠生存率Fig.7 Survival rate of 4T1 tumor-bearing mice

图8 4T1荷瘤小鼠肿瘤体积变化Fig.8 Changes in tumor volume of 4T1 tumor-bearing mice

图9 4T1荷瘤小鼠肿瘤展示图Fig.9 Tumor display image of 4T1 tumor-bearing mice

图10 4T1荷瘤小鼠肿瘤质量Fig.10 Tumor weight in 4T1 tumor-bearing mice

2.6 荷瘤小鼠肺结节数量 对照组、紫杉醇组和MVHu191 组小鼠肺结节数量分别为（24.00 ± 3.664）、（12.60±2.073）和（13.00±2.280）个，MV-Hu191组显著低于对照组（F=33.792，P=0.000），与紫杉醇组接近，见图11。提示MV-Hu191可能具有抑制4T1荷瘤小鼠肿瘤转移的作用。

图11 4T1荷瘤小鼠肺结节数量Fig.11 Number of pulmonary nodules（pieces）in 4T1 tumorbearing mice

2.7 荷瘤小鼠肿瘤组织和肺组织病理特征

2.7.1 肿瘤组织 对照组细胞间隙增大，细胞连接稀疏，可见长梭或不规则样改变，伴有血管形成；MVHu191 组细胞间隙小，细胞连接紧密，多见椭圆形或圆形，无血管形成；紫杉醇组细胞间隙减小，形态由长梭型向圆形转化，部分肿瘤细胞萎缩裂解，坏死。见图12。

图12 各组小鼠肿瘤组织病理变化（HE染色，×400）Fig.12 Pathological changes of tumor tissue of mice in various groups（HE staining，×400）

2.7.2 肺组织 对照组肺组织结构基本消失，满视野大面积肿瘤细胞；MV-Hu191 组肺泡、肺泡囊等肺组织结构多数完整，少见肺泡轮廓断裂，肿瘤细胞浸润；紫杉醇组肺组织结构完整，肺泡和肺间隔清晰可见。见图13。

图13 各组小鼠肺组织病理变化（HE染色，×400）Fig.13 Pathological changes in lung tissue of mice in various groups（HE staining，×400）

2.8 荷瘤小鼠肿瘤组织EMT相关蛋白的表达 免疫组化染色结果显示，MMP-2、MMP-9、E-cadherin 蛋白的阳性着色常位于细胞膜和细胞质，见图14。与对照组相比，MV-Hu191 组肿瘤组织MMP-2、MMP-9 蛋白表达下降（F分别为6.705和9.047，P分别为0.028和0.023），E-cadherin 蛋白表达上升（F= 3.468，P=0.039），但低于紫杉醇组，见图15。表明MV-Hu191能调节4T1 荷瘤小鼠肿瘤组织EMT 通路蛋白表达，进一步证实MV-Hu191 具有抑制4T1 肿瘤细胞迁移的作用。

图14 各组小鼠肿瘤组织的免疫组化染色结果（×400）Fig.14 Immunohistochemical staining display of tumor tissue of mice in various groups（×400）

图15 各组小鼠免疫组化阳性细胞数比例Fig.15 Percentage of immunohistochemistry positive cells of mice in various groups

3 讨论

乳腺癌是严重危害女性健康的常见肿瘤。迄今为止，其在女性恶性肿瘤中发病率居第一位，造成了极大的疾病负担。TNBC 由于缺乏ER、PR、HER2 表达，无法接受内分泌治疗，目前通常采用手术为主，辅助化疗和放疗，但放化疗具有严重的毒副作用。因此，亟需一种有效的治疗手段以定向精确靶位治疗。MV 可特异性侵袭肿瘤细胞并诱导免疫应答发挥抗肿瘤的特性［14-15］，使其成为乳腺癌治疗的一种新型方法。本研究探讨了MV-Hu191体内外干预4T1细胞增殖及迁移的作用，结果表明，其具有抑制4T1细胞增殖及迁移能力的作用，进而抑制4T1荷瘤小鼠肿瘤进展及延长小鼠生存期。FOY等［16-17］发现，MVFHER 溶瘤肽嵌合体对MDA-MB-468细胞的抑制率明显增加，并延缓人TNBC MDA-MB-468乳腺癌小鼠模型肿瘤体积增长，免疫组化结果显示，与迁移相关的微血管密度显著减少；JING 等［18-19］改造的重组尿激酶受体麻疹溶瘤病毒（MV-uPA）作用4T1荷瘤小鼠后，小鼠生存期为35 d，对照组为25 d，同时，MV-uPA 延迟了4T1 荷瘤小鼠肺转移进展，下调了EMT 相关基因［Delta 样配体-4（D-like ligand 4，DLL-4）、血管生成素2（angiopoietin 2，Ang 2）、血小板内皮细胞黏附分子（platelet endothelial cell adhesion molecule，PECAM）和免疫球蛋白样EGF样域酪氨酸激酶-1（tyrosine kinase with immunoglobulin like and EGF like domain protein 1，Tie-1）等］。上述研究表明，麻疹溶瘤病毒具有抑制TNBC转移的作用，但具体机制尚未阐明。据此，本研究通过对肿瘤组织EMT通路蛋白进行检测，发现MV抑制TNBC转移可能与EMT通路蛋白表达有关。

研究发现，EMT的异常激活与TNBC的复发和转移密切相关［20-21］，MMP-2、MMP-9和E-cadherin等基因作为EMT 标志物，已被证实与TNBC 侵袭和转移相关，且是溶瘤病毒抑制乳腺癌转移的信号通路和靶点之一［22-23］。ZHAO等［24］发现，溶瘤腺病毒rAd.DCN可下调肿瘤组织中核心蛋白聚糖靶基因，进而降低EMT转化标志物VEGF表达水平，抑制4T1乳腺癌模型小鼠肿瘤生长和肺转移；ANG 等［25］报道，溶瘤腺病毒Ad5F11bSP株可上调MDA-MB-231 模型小鼠肿瘤组织E-cadherin 水平，抑制肿瘤细胞转移；SHI 等［26］报道，溶瘤水疱性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）重组基质蛋白干预4T1 乳腺小鼠后，肿瘤组织MMP-9表达减少。本研究结果显示，与对照组相比，MV-Hu191 显著上调了肿瘤组织EMT 通路蛋白Ecadherin，下调了MMP-2 和MMP-9 表达，与其他溶瘤病毒抑制乳腺癌迁移EMT蛋白表达一致。可见MVHu191抑制TNBC转移可能与EMT蛋白表达有关。

综上所述，本研究通过体内外试验探讨了MVHu191对乳腺癌4T1细胞荷瘤小鼠的影响，结果显示，MV-Hu191 可明显抑制4T1 细胞增殖及迁移，显著减小4T1 荷瘤小鼠的肿瘤质量及转移肺结节数量，显著延长了小鼠生存周期，其可能的初步机制与通过调节EMT 通路蛋白表达相关。本研究为MV-Hu191 作为TNBC 潜在的抗癌制剂研究奠定了基础。但MVHu191如何调控EMT 通路蛋白及其上游调控分子及下游效应分子具体作用靶点尚需深入研究。