王艺博，夏青娟，王昕雷，徐涵禹，白鸽，郑书君，徐艳玲

长春生物制品研究所有限责任公司疫苗二室，吉林 长春 130012

甲型病毒性肝炎（hepatitis A，简称甲肝），是由甲型肝炎病毒（hepatitis A virus，HAV）引起的一种以肝脏损伤为主的急性肠道传染性疾病［1］。甲肝多为自限性疾病［2］，主要通过“粪-口”途径传播［3］，主要临床表现为黄疸、发热、恶心、肝功能异常等症状［4］。据WHO 统计，每年约有150 万人感染HAV［5］。甲肝大规模流行与暴发将严重影响人民生命健康和生活水平，预防和控制甲肝流行的最有效手段是接种甲肝疫苗［6］。

采用以铝为基础的复合物作为佐剂增强疫苗免疫效果，已广泛应用于各类疫苗的生产制备［7］。铝佐剂通常分为3 种，包括氢氧化铝［Al（OH）₃］、磷酸铝和明矾，其中Al（OH）₃应用最广泛，已被国际公认为安全、有效的佐剂之一［8］。Al（OH）₃对抗原有吸附作用，大部分疫苗中，Al（OH）₃对抗原吸附率越高，其免疫效果越好，但也存在吸附率过高不利于抗原释放，反而影响免疫效果的情况［9-10］。本研究采用单因素筛选及正交试验对Al（OH）₃佐剂与HAV抗原吸附条件进行优化，并通过动物实验初步评价吸附产物的免疫效果。

1 材料与方法

1.1 原液 HAV 原液（经灭活、层析纯化）由长春生物制品研究所有限责任公司疫苗二室提供。

1.2 主要试剂 Al（OH）₃佐剂Alhydrogel®购自丹麦Croda Denmark 公司；磷酸氢二钠（Na2HPO4）及磷酸二氢钠（NaH2PO4·H2O）均购自湖南九典制药股份有限公司；氯化钠（NaCl）购自天津海光药业股份有限公司；HAV 抗原定量检测试剂盒（ELISA 法）及HAV抗体定性检测试剂盒（ELISA 法）均购自北京万泰生物药业股份有限公司。

1.3 实验动物 SPF 级NIH 小鼠，雌雄各半，3～4 周龄，体质量14～16 g，由长春生物制品研究所有限责任公司实验动物室提供，动物许可证号为：SCXK（吉）-2017-0005。本实验均以科研为目的进行小鼠的养殖和使用，且按照动物伦理相关规定进行。

1.4 Al（OH）₃佐剂与HAV抗原吸附条件的单因素筛选

1.4.1 缓冲盐终摩尔浓度的确定 用PBS 分别稀释Al（OH）₃溶液和HAV 原液，调节pH 为6.3。将稀释的Al（OH）₃溶液加至稀释的HAV原液中，以等体积分数混合，使铝含量终浓度为0.5 mg／mL，HAV抗原终含量为1∶1 024，NaCl终摩尔浓度为0.15 mol／L，缓冲盐终摩尔浓度分别为0.01、0.02 和0.04 mol／L。将样品充分振荡，2～8 ℃吸附24 h（间歇振荡），检测吸附效果。试验重复3次。

1.4.2 pH的确定 按1.4.1项方法制备及检测样品，其中样品缓冲盐终摩尔浓度为0.01 mol／L，pH 分别设为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0。

1.4.3 NaCl 终摩尔浓度的确定 按1.4.1 项方法制备及检测样品，其中样品缓冲盐终摩尔浓度为0.01 mol／L，NaCl 终摩尔浓度分别设为0.075、0.13、0.15、0.17、0.45、0.75、1.0 mol／L。

1.4.4 混合方式的确定 共制备2组样品（A和B组），A组的混合方法同1.4.1项；B组样品用HAV 原液直接稀释Al（OH）₃溶液，其他过程同1.4.1 项。2 组样品缓冲盐终摩尔浓度均为0.01 mol／L。

1.4.5 滴加顺序的确定 共制备2组样品（A和B组），A组为HAV原液滴加至Al（OH）₃溶液中；B组为Al（OH）₃溶液滴加至HAV原液中。其他过程同1.4.1项。2 组样品缓冲盐终摩尔浓度为0.01 mol／L。

1.5 Al（OH）₃佐剂与HAV抗原吸附条件的正交试验设计 基于单因素筛选结果，以pH 及缓冲盐和NaCl 终摩尔浓度为影响因素，Al（OH）₃吸附率为评价指标，进行3 因素3 水平正交试验设计，见表1，共设计9 组试验，见表2。同1.4.1 项方法配制正交试验样品，混合方式及滴加顺序为将HAV 原液滴加至Al（OH）₃溶液中。

1.6 吸附效果的检测 根据《中国药典》三部（2020版）甲肝灭活疫苗半成品检定方法进行铝吸附效果测定［11］。吸附样品经400×g离心3 min，取上清液，采用HAV 抗原定量检测试剂盒（ELISA 法）检测上清中抗原浓度，并按下式计算Al（OH）₃吸附率，吸附率应>95%。

1.7 免疫原性的检测 采用最优和次优组合制备吸附样品，分别经腹腔免疫NIH 小鼠，0.5 mL／只，同时设阴性对照组［仅免疫Al（OH）₃溶液］及空白对照组（不免疫），每组10 只，雌雄各半。于免疫后28 d，经眼球或心脏采血，分离血清，采用HAV 抗体定性检测试剂盒（ELISA 法）检测HAV 抗体水平。以样品A450／630

1.8 统计学分析 应用SPSS 26.0软件进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析、LSD多重比较及独立样本t检验，以P< 0.05 为差异有统计学意义。正交试验结果采用方差分析方法，以F和P（F越大，P越小，表明因子对结果影响力越大）结合极差R（R值越大表明因子对结果影响力越大）判断因子对吸附效果的影响，再根据K（K最大值为最优水平）筛选出最优和次优组合。

2 结果

2.1 Al（OH）₃佐剂与HAV 抗原吸附条件的单因素筛选

2.1.1 缓冲盐终摩尔浓度的确定 0.01、0.02 和0.04 mol／L组样品的Al（OH）₃吸附率分别为99.51%、99.37%和98.70%，均>95%。经单因素方差分析，3组间Al（OH）₃吸附率差异有统计学意义（F= 6.582，P=0.031）；经LSD多重比较，0.02 和0.01 mol／L组Al（OH）₃吸附率明显高于0.04 mol／L 组（P分别为0.015 和0.031），0.01 与0.02 mol／L 组间差异无统计学意义（P= 0.579）。表明缓冲盐终浓度为0.01和0.02 mol／L时吸附效果较好。

2.1.2 pH的确定 pH 5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0组Al（OH）₃吸附率分别为99.04%、99.32%、99.32%、99.27%、98.66%和98.36%，均>95%。经单因素方差分析，6 组间Al（OH）₃吸附率差异有统计学意义（F=14.007，P=0.001）；经LSD多重比较，pH 5.5、6.0、6.5和7.0组间差异均无统计学意义（P=0.083～0.983），pH 7.5 和8.0 组间差异无统计学意义（P= 0.066），pH 5.5~7.0组均明显高于pH 7.5~8.0组（P=0.01~0.30）。表明Al（OH）₃吸附HAV 抗原的最适pH 为5.5～7.0。

2.1.3 NaCl 终摩尔浓度的确定 NaCl 终摩尔浓度0.075、0.13、0.15、0.17、0.45、0.75、1.0 mol／L 组的Al（OH）₃吸附率分别为98.68%、99.04%、99.35%、99.21%、98.66%、91.85%和94.03%，其中0.13、0.15、0.17 mol／L组均>99%。经单因素方差分析，7组间Al（OH）₃吸附率差异有统计学意义（F= 8.612，P=0.001）；经LSD多重比较，NaCl终摩尔浓度0.075、0.13、0.15、0.17 和0.45 mol／L 组间差异均无统计学意义（P= 0.652 ~ 0.991），0.75 与1.0 mol／L 组差异无统计学意义（P= 0.158），0.075、0.13、0.15、0.17 和0.45 mol／L 组明显高于0.75 和1.0 mol／L 组（P=0.001~0.007）。表明Al（OH）₃吸附HAV抗原的最适NaCl终摩尔浓度为0.13～0.17 mol／L。

2.1.4 混合方式的确定 A和B组的Al（OH）₃吸附率分别为99.15%和99.25%，均>99%，两组差异无统计学意义（t=-0.696，P=0.525）。表明两种混合方式对Al（OH）₃佐剂吸附HAV抗原的效果无影响。

2.1.5 滴加顺序的确定 A和B组的Al（OH）₃吸附率分别为99.02%和98.67%，两组差异无统计学意义（t=1.153，P=0.313）。表明不同滴加顺序对Al（OH）₃佐剂吸附HAV抗原的效果无影响。

2.2 正交试验结果 9 组试验的Al（OH）₃吸附率均>95%，其中1、3、8和9组<99%，其他组均>99%。对正交试验结果进行方差分析，各因子主体间效应检验中仅有缓冲盐终摩尔浓度对Al（OH）₃吸附率影响显著（F=48.978，P=0.02），pH 和NaCl 终摩尔浓度结果不显著（F分别为7.925和5.298，P分别为0.112和0.159），确定3因素影响Al（OH）₃吸附率大小依次为：缓冲盐终摩尔浓度> pH > NaCl 终摩尔浓度，与极差R值反应结果一致。根据K值得出最优组合为：pH 6.3+缓冲盐终摩尔浓度0.01 mol／L+NaCl终摩尔浓度0.15 mol／L，次最优组合为：pH 5.8 +缓冲盐终摩尔浓度0.02 mol／L + NaCl 终摩尔浓度0.17 mol／L。见表3。

表3 正交试验结果Tab.3 Results of orthogonal tests

2.3 小鼠血清的抗体水平 Cutoff值参考品的A450／630为1.166。最优和次优组合组小鼠血清抗体A450／630均<1.166，全部阳转（各10 只），阳转率均为100%；阴性对照组和空白对照组小鼠血清抗体A450／360均≥1.166，阳转数量及阳转率均为0。表明优化条件制备的吸附样品具有良好的免疫原性。

3 讨论

铝盐或Al（OH）₃自确定可作为佐剂以来［12］，已广泛应用于人用疫苗，包括细菌类疫苗（百白破疫苗）及病毒类疫苗（甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、森林脑炎疫苗、出血热疫苗和新型冠状病毒疫苗等）［13］，且安全性良好［14-15］。虽然铝佐剂在抗原提呈细胞中的佐剂效应机制尚未明确［16］，但其增强疫苗免疫效果的能力是明确的。铝佐剂应用范围涵盖传统疫苗及基因工程类疫苗，包括近年已上市和研发的新型冠状病毒疫苗。Al（OH）₃佐剂吸附抗原的方式主要有静电吸引、疏水作用和配基交换［17］，不同吸附方式的吸附效果不同。有文献报道，Al（OH）₃佐剂吸附效果对其发挥免疫增强作用具有重要影响［18］。影响Al（OH）₃疫苗吸附能力的因素主要有抗原含量、pH、缓冲液离子浓度等。理论上，将Al（OH）₃与抗原在其最适吸附条件下进行混合，可增强疫苗的免疫效果。

目前，国内外甲肝灭活疫苗，除了瑞士Crucell Switzerland AG 研制的爱巴苏®使用脂质体佐剂［免疫增强性重组流感病毒体（immunopotentiating reconstituted influenza virosomes，IRIVs）］以外，其他均使用铝佐剂。本研究以HAV原液为基础，为优化Al（OH）₃与HAV 抗原的最适吸附条件，选取缓冲盐终摩尔浓度、pH、NaCl 终摩尔浓度、混合方式及滴加顺序等因素进行单因素筛选，以Al（OH）₃吸附HAV 抗原的吸附效果为指标进行评价，再通过正交试验对筛选出的因素进行优化，并采用最优及次优组合条件制备吸附样品，检测其在小鼠体内的免疫原性。单因素筛选结果表明，缓冲盐终摩尔浓度、pH、NaCl终摩尔浓度对Al（OH）₃吸附HAV 抗原影响较大，最适吸附条件分别为：缓冲盐终摩尔浓度为0.01 和0.02 mol／L、pH 为5.5～7.0、NaCl 终摩尔浓度为0.13～0.17 mol／L。混合方式和滴加顺序对吸附效果无影响。正交试验结果显示，影响Al（OH）₃吸附率大小的因素依次为：缓冲盐终摩尔浓度>pH > NaCl 终摩尔浓度，根据K得到Al（OH）₃吸附HAV 抗原最优组合为：pH 6.3+缓冲盐终摩尔浓度0.01 mol／L + NaCl 终摩尔浓度0.15 mol／L，次优组合为：pH 5.8+缓冲盐终摩尔浓度0.02 mol／L+NaCl 终摩尔浓度0.17 mol／L。最优及次优组合组小鼠血清抗体阳转率均为100%，表明吸附样品具有良好的免疫原性。

本研究初步优化了Al（OH）₃佐剂与HAV 抗原的吸附条件，且吸附产物具有良好的免疫原性。本研究为甲肝灭活疫苗的研究提供了参考，后续还将在抗体含量及是否产生细胞免疫等方面进行深入研究。