赵婷婷，任秀秀，王轶男，李实实，黄秋芳，王晓杰，张晓焕，卫江波，苏文浩

国药中生生物技术研究院有限公司卫江波实验室，北京 101111

水疱性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）属于弹状病毒科、水疱病毒属，主要分为2 个血清型，代表株分别为印第安纳株（Indiana）和新泽西株（New Jersey）。VSV为单股负链RNA 病毒，其基因组全长约11 000 bp，其3'端为前导序列（leader），之后依次为5个结构基因N、P、M、G、L，分别编码5种结构蛋白：核蛋白（nucleoprotein，N）、磷蛋白（phosphoprotein，P）、基质蛋白（matrix protein，M）、糖蛋白（glycoprotein，G）和RNA依赖的RNA聚合酶（RNA dependent RNA polymerase，RdRp），5'端为尾随序列（trailer），相邻基因之间为保守的间隔序列。VSV 基因组与N、P、L 蛋白共同构成核糖核蛋白复合体（ribonucleoprotein complex，RNP），RNP 为病毒感染性的基本单位，与病毒的复制和转录过程紧密相连。M 蛋白作为连接蛋白位于病毒包膜内侧，连接RNP 与包膜。G 蛋白以同源三聚体形式存在于病毒包膜表面，促使病毒与细胞接触并进入细胞［1］。

VSV 改造为病毒载体具有多种优点：VSV 生活周期仅在细胞质中进行，无染色体整合风险；各基因的转录相互独立，在基因间隔区域可引入额外的转录单元表达外源基因，或将VSV G蛋白替换为外源蛋白［2］；免疫接种途径有肌肉注射、鼻内给药或口服［3-4］；在哺乳动物细胞中培养滴度较高，易于规模化培养［5］。因此，VSV 载体被广泛应用于新型疫苗研究中，包括埃博拉病毒［6］、马尔堡病毒［7］、人类免疫缺陷病毒［8］、呼吸道合胞病毒［9］、尼帕病毒［10］和SARS-CoV-2［11］等的疫苗研究。

狂犬病病毒（rabies virus，RV）与VSV 同属弹状病毒科，基于VSV 载体构建的狂犬病疫苗免疫小鼠可诱导产生具有保护性水平的中和抗体［12］。RV G蛋白作为病毒包膜表面唯一的蛋白，是狂犬病疫苗中最为有效的保护性抗原，能刺激机体产生中和抗体［13］。本研究将VSV 的G基因替换为RV 的G基因，构建表达RV G 蛋白的嵌合型重组VZV，并进行鉴定，为后续以VSV 为载体的反向遗传学技术平台的构建奠定基础。

1 材料与方法

1.1 质粒及细胞 VSV 骨架质粒pUC57-kan-simple-VSV［系将VSV反基因组克隆至载体pUC57-kan-simple中，VSV 反基因组5'端插入T7 启动子，3'端插入T7终止子和丁肝核酶（HDV ribozyme，δ）］、表达T7聚合酶的质粒pCA-T7 和分别表达VSV N、P、L 蛋白的辅助质粒pCA-N、pCA-P、pCA-L 均由本公司卫江波实验室构建；293T 细胞和Vero 细胞均由本公司卫江波实验室保存。

1.2 主要试剂及仪器 磷酸钙转染试剂盒购自美国Invitrogen 公司；DMEM 培养基购自美国Gibco 公司；RV G 蛋白兔多克隆抗体和FITC 标记RV G 蛋白兔多克隆抗体购自美国Abcam 公司；HRP 标记山羊抗兔IgG购自美国SouthernBiotech公司；病毒RNA提取试剂盒和逆转录试剂盒购自日本TaKaRa 公司；PCR仪购自美国Bio-Rad 公司；倒置荧光显微镜购自日本Olympus公司。

1.3 携带RVG基因重组VSV反基因组质粒的构建 由生工生物工程（上海）股份有限公司将质粒pUC57-kansimple-VSV 中的VSVG基因替换为狂犬病疫苗CTN-1 株（GenBank：FJ959397）的G基因，其编码G 蛋白第333 位精氨酸替换为谷氨酸（Arg333→Glu333），重新构建的质粒命名为pUC57-VSV-RVG，质粒结构示意图见图1。

图1 质粒pUC57-VSV-RVG结构示意图Fig.1 Schematic diagram of plasmid pUC57-VSV-RVG structure

1.4 重组病毒的拯救 用含10%胎牛血清的DMEM完全培养基培养293T 细胞，细胞传代至6 孔板培养过夜，细胞汇合度为70%~90%时，采用磷酸钙法转染质粒，按照试剂盒说明书操作，每孔质粒转染量为：2 μg pUC57-VSV-RVG、2 μg pCA-T7、2 μg pCAN、2 μg pCA-P、0.5 μg pCA-L，转染细胞于37 ℃，5%CO2培养箱培养3 d；将Vero细胞用含3%胎牛血清的DMEM 培养基重悬，密度为1 × 105个／mL，弃去转染孔中培养液，每孔加入2 mL Vero 细胞悬液，继续培养3 d；以少量培养上清重悬孔中细胞，并于液氮、37 ℃水浴反复冻融3 次，离心收获上清液，感染Vero细胞；细胞病变达50%以上时收获病毒，并在Vero细胞上连续传代5 次。将病毒于-70 ℃冻存，用于对重组病毒的进一步生物学特性分析。

1.5 重组病毒的RT-PCR 鉴定 按照病毒RNA 提取试剂盒说明书抽提重组病毒VSV-RVG 的基因组RNA，以随机引物将基因组RNA 逆转录为cDNA，以其为模板，PCR扩增RVG片段。上游引物：5'-ATGATTCCTCAGGCCCTGCT-3'，下游引物：5'-TTACAGCTTGGTCTCGCCGC-3'，扩增片段大小为1 575 bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反应条件为：98 ℃30 s；98 ℃10 s，55 ℃30 s，72 ℃50 s，共30 个循环；72 ℃10 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，送北京擎科生物科技有限公司测序。

1.6 重组病毒RV G蛋白表达的鉴定

1.6.1 免疫荧光法 用DMEM 完全培养基培养Vero细胞，将细胞传代至24 孔板培养过夜，细胞汇合度为90%以上时接种重组病毒VSV-RVG，于37 ℃，5%CO2培养箱培养3 d；弃去培养液，PBS 洗涤细胞后，用预冷的甲醇4 ℃固定10 min，弃去甲醇，PBS 洗涤细胞，加入FITC 标记RV G 蛋白兔多克隆抗体（1∶250 稀释），37 ℃孵育1 h；PBS 洗涤细胞后，于倒置荧光显微镜下观察。

1.6.2 Western blot 法 将重组病毒VSV-RVG 感染Vero细胞的裂解液与蛋白质上样缓冲液混合（以Vero细胞裂解液为对照），100 ℃加热5 min，4% ~ 15%SDS-PAGE 分离样品，电转移至PVDF 膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h；加入RV G 蛋白兔多克隆抗体（1∶250 稀释），4 ℃过夜孵育；PBST 洗涤，加入HRP标记山羊抗兔IgG（1∶1 000 稀释），室温孵育1 h；PBST洗涤，加入TMB显色。

1.7 重组病毒滴度测定 将病毒用DMEM 完全培养基10 倍系列稀释，加入96 孔板中，100 μL／孔，每个稀释度设8 个复孔，再将Vero 细胞悬液稀释至2 ×105个／mL，接种至96 孔板中，100 μL／孔，与病毒液混合，同时设不加病毒的细胞对照，37 ℃，5%CO2培养箱培养7 d 后判定结果，Reed-Muench 法计算细胞半数感染剂量（TCID50）。

1.8 重组病毒生长曲线的绘制 将6×106个Vero细胞接种于T75 细胞培养瓶中，细胞长满单层后，弃培养液，用含3%胎牛血清的DMEM培养基配制病毒感染液，按MOI=0.001接种Vero细胞，于35 ℃，5%CO2培养箱培养，感染后1、2、3、4、5 d分别收集培养液上清，测定病毒滴度，并绘制病毒生长曲线。

1.9 数据采集及分析 通过Microsoft Excel软件进行绘图及数据分析。

2 结果

2.1 重组病毒的拯救 将重组病毒骨架质粒pUC57-VSV-RVG和辅助质粒pCA-N、pCA-P、pCA-L、pCA-T7共转染293T 细胞，转染细胞的裂解上清感染Vero 细胞后，细胞出现圆缩、脱落现象，而对照Vero 细胞无此现象，见图2。

图2 重组病毒在Vero上的细胞病变效应（×40）Fig.2 Cytopathic effects of recombinant virus on Vero cells（×40）

2.2 重组病毒的RT-PCR 鉴定 重组病毒基因组中RVG片段扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，可见约1 600 bp 的特异性条带，大小与预期相符，见图3。扩增片段测序结果显示，P1~P5代病毒G蛋白第493 位氨基酸密码子由TCT 突变为CCT，编码的氨基酸由丝氨酸突变为脯氨酸，突变位于G蛋白胞内区。

图3 重组病毒RV G基因RT-PCR扩增产物电泳图Fig.3 Electrophoretic profile of RT-PCR amplification product of recombinant virus RV G gene

2.3 重组病毒RV G蛋白的表达

2.3.1 免疫荧光法 荧光显微镜下观察显示，P1 ~P5 代重组病毒感染的Vero 细胞可见大量绿色荧光，对照细胞未见绿色荧光，见图4。

图4 免疫荧光法检测Vero细胞中RV G蛋白的表达（×40）Fig.4 Immunofluorescence detection of RV G protein in Vero cells（×40）

2.3.2 Western blot 法 重组病毒感染的Vero 细胞裂解液在相对分子质量约65 000 处可见特异性条带，大小与理论值相符，而对照细胞裂解液未见明显条带，见图5。

图5 Western blot 法检测重组病毒感染的Vero 细胞裂解液中RV G蛋白的表达Fig.5 Analysis of RV G protein expression in lysate of Vero cells infected with recombinant virus by Western blot

2.4 重组病毒的滴度及生长曲线 重组病毒感染Vero细胞3 d后滴度可达7 lgTCID50／mL以上，第4天达峰值（8.43 lgTCID50／mL），见图6。重组病毒在Vero细胞上连续传代5次，滴度稳定在7.5~8.5 lgTCID50／mL之间，见图7。

图6 VSV-RVG生长曲线Fig.6 Growth kinetics of VSV-RVG

图7 P1~P5代VSV-RVG的滴度Fig.7 Titers of VSV-RVG of passage P1~P5

3 讨论

犬是狂犬病的的主要传染源，在欧美，通过免疫犬使人和犬狂犬病感染率显著下降［14］。我国犬数量大且狂犬病疫苗免疫率不足，使用注射用疫苗操作难度大，而口服疫苗更为方便，利于推广，便于扩大免疫覆盖率［15］。病毒载体狂犬病疫苗是将RV G 蛋白基因插入其他病毒载体中，在体内表达G 蛋白以激发机体的体液免疫和细胞免疫，可被开发成口服疫苗。5 型腺病毒载体狂犬病疫苗（ONRAB）［16］和痘病毒载体狂犬病疫苗（V-RG）［17］作为兽用口服疫苗，在欧美发达国家野生动物狂犬病控制中得到广泛应用且效果显著。本研究使用的嵌合型VSV 载体是将VSVG基因替换为与G基因具有类似功能的外源病毒结构基因，已广泛应用于疫苗研究中。VSV 与RV同属弹状病毒科，种间差异小，二者G 蛋白具有类似的结构与功能，将VSV 基因组中的G基因用RVG替代，可保证重组嵌合病毒的可复制性和遗传稳定性。

构建表达外源病毒包膜蛋白的重组病毒载体，有时需将外源膜蛋白的胞内区和跨膜区替换为病毒载体自身膜蛋白的相应区域，以确保外源膜蛋白整合至重组病毒颗粒中以及重组病毒的传代稳定性［18］。而RV G 蛋白的跨膜区和胞内区对G 蛋白形成正确空间结构具有重要影响，正确结构的G 蛋白才具有充分的免疫原性［19-20］。本研究选择以G 蛋白全长替代VSV G 蛋白，构建的重组病毒可通过RT-PCR、免疫荧光法和Western blot 检测到RV G 蛋白表达，且具有良好的遗传稳定性，病毒在Vero 细胞上连续传代5 次，滴度稳定在7.5 ~ 8.5 lgTCID50／mL 之间，RV G蛋白均可稳定表达。

病毒载体的预存免疫是以病毒载体开发重组疫苗的主要障碍之一，因为针对病毒的中和抗体能中和进入体内的病毒载体，进而影响载体感染细胞，导致进入细胞内的重组病毒数量减少，影响外源蛋白的表达［21］。借助反向遗传操作技术缺失VSV包膜表面唯一蛋白G 蛋白，使其完全被相应功能的RV G 蛋白取代，装配于重组病毒粒子表面，形成嵌合型重组病毒，应更易克服VSV载体预存免疫的影响。

狂犬病灭活疫苗生产株CTN-1 与国内多数街毒株G蛋白氨基酸序列的同源性大多在92.4%~97.7%，高于aG、PV 等其他疫苗株［22］，因此，本研究中RVG基因使用CTN-1 株G 蛋白编码序列。G 蛋白第333位精氨酸是RV毒力的关键位点［23-24］，由RV SAD-Bern株加压筛选得到的SAG1 减毒株G 蛋白第333 位氨基酸由精氨酸变为丝氨酸（Arg333→Ser333）、SAG2 减毒株变为谷氨酸（Arg333→Glu333），由于毒力的关键位点第333 位精氨酸发生了改变，SAG1 和SAG2 减毒株显示出更低的残余毒力，对成年小鼠和其他野生啮齿动物经口服、肌肉、脑内途径接种均不致病，但并未影响其免疫效果［25］。为降低嵌合病毒的毒性，本研究将CTN-1 株G 蛋白编码序列第333 位精氨酸突变为谷氨酸。

综上所述，本研究以嵌合型VSV为载体，成功构建了表达RV G蛋白的嵌合型重组VSV，为后续以VSV为载体的反向遗传学技术平台的构建奠定了基础。