韩露，周扬，方如男，屈双擎，陈兵，李建红

（北京中医药大学东直门医院，北京 100700）

当归饮子首载于《严氏济生方》[1]，有益气养血、祛风止痒的功效，是治疗慢性自发性荨麻疹（Chronic spontaneous urticaria，CSU）的经典方剂，方药组成为当归、生地、川芎、白芍、防风、白蒺藜、荆芥、何首乌、黄芪以及甘草10 味中药，主要用于治疗血虚风燥及气血两虚型慢性荨麻疹，临床疗效确切[2-3]。有研究表明，当归饮子治疗CSU 可能通过增强细胞自噬水平、抑制迟发相过敏反应、调节免疫功能、抑制过敏性炎性反应等实现[2，4-5]。然而中药复方的成分多样，作用机制牵涉多靶点、多环节，当归饮子治疗CSU 的药效成分和作用机制尚不完全明确。

网络药理学是将多元药理网络映射到人类疾病-基因网络上，区别于传统的“一种药物针对一种疾病的一个靶点”假设，网络药理学可以系统地阐释多种药物活性成分与疾病基因间复杂的相互作用，更有利于对复杂疾病治疗机制的探索[6-7]。而中药复方亦有多成分、多靶点的特点，所以网络药理学近年来被愈来愈多地应用于中药复方效应机制的研究中。本研究采用网络药理学方法分析当归饮子治疗CSU 的药效成分和作用靶点，为进一步研究当归饮子的药理作用机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要化学成分的收集和筛选 利用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php）并结合中药分子机制在线分析工具（BATMAN-TCM，http：//bionet.ncpsb.org/batmantcm/index.php），收集当归、生地黄、川芎、白芍、防风、蒺藜、荆芥、何首乌、黄芪和甘草的主要化学成分，以口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18 作为筛选参数[8]。另外结合文献研究，将未能符合筛选参数，但是有明确药理作用的成分也纳入候选。

1.2 靶点收集 利用TCMSP 数据库检索候选活性成分靶点，剔除没有靶点的活性成分。将收集整理到的靶点导入蛋白质数据库（Uniprot，https：//www.uniprot.org/），限定物种为人，剔除非人源靶点，将所有靶基因名称校正为官方名称（Offical gene symbol）。

在GeneCards 数据库（https：//www.genecards.org/）及OMIM 数据库（https：//omim.org/）中通过检索关键词“chronic spontaneous urticaria”收集疾病相关靶点，通过R 语言进行活性成分靶点和CSU 疾病靶点的匹配并绘制Venn 图，得到二者交集靶点基因。

1.3 网络的构建 使用CytoScape 3.8.0（https：//cytoscape.org/）软件构建药物-活性成分-作用靶点-疾病网络；使用String 在线工具（https：//string-db.org/）获取共有靶点蛋白质相互作用信息，构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，用CytoScape 软件进行可视化处理。

1.4 网络的分析 利用CytoScape 的插件CytoNCA对上述网络进行拓扑分析，计算网络中每个节点的点度中心性（DC）、中介中心性（BC）、接近中心性（CC）和特征向量中心性（EC）。这些参数是评价网络节点重要性或影响力的指标，数值越大，说明节点越处于网络的核心地位。根据拓扑参数筛选网络核心活性成分及核心靶点。

1.5 分子对接验证 从蛋白质结构数据库（PDB，http：//www.rcsb.org/）获取核心靶点的蛋白结构，从有机小分子生物活性数据库（PubChem，https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取相应活性成分的分子结构，使用AutoDock-Vina 软件（http：//vina.scripps.edu/index.html）对核心靶点与活性成分进行分子对接验证，并使用PyMOL 软件（https：//pymol.org/2/）进行可视化处理。

1.6 基因功能和通路富集分析 使用DAVID 数据库（https：//david.ncifcrf.gov/），限定物种为人，对药物-疾病共有靶点进行基因本体生物过程（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）注释分析。使用微生信在线数据分析平台（http：//www.bioinformatics.com.cn/）对富集分析结果进行可视化，分析当归饮子活性成分显著影响的生物过程和信号通路，探讨当归饮子治疗CSU 的作用机制。

2 结果

2.1 当归饮子主要化学成分的收集与筛选 剔除无靶点的化学成分后，共得到有效活性成分154个，其中当归6 个、何首乌7 个、生地黄4 个、川芎10 个、白芍9 个、防风18 个、蒺藜8 个、荆芥11 个、黄芪18 个和甘草88 个，部分化学成分存在于多种中药中。

2.2 靶点收集 共预测到154 个活性成分对应的2 621 个作用靶点。于GeneCards 数据库与OMIM 数据库分别得到817 和80 个靶点，去重后得到889个CSU 疾病相关靶点。其中活性成分和疾病的共同靶点120 个，见图1，对应当归饮子的138 个活性成分，见表1。

表1 当归饮子的活性成分信息

续表

图1 Venn 图

2.3 药物-靶点-疾病相互作用网络的构建和分析 药物-活性成分-作用靶点-疾病网络模型如图2 所示，图中138 个活性成分对应到CSU 的120 个潜在靶点上，其中深绿色节点代表共有靶点，橙色节点代表单一药物成分，粉色节点代表药物共有成分，节点大小与DC 值成正比。利用CytoNCA 工具计算网络节点的DC、BC、CC 和EC 值。一般认为DC 值≥2 倍中位数的节点为网络中的重要节点，所以利用DC≥12 并结合BC、CC、EC 中位数，BC≥33.255 7、CC≥0.3982 71 以及EC≥0.0285 11 筛选网络，得到的节点中活性成分节点占17 个，其中何首乌2 个，分别为白藜芦醇和大黄素；荆芥1 个，为木犀草素；黄芪2 个，为7-O-甲基异丁香酚、黄芪紫檀烷；甘草6 个，分别为甘草甜素、柚皮素、驴食草酚、7-甲氧基-2-甲基异黄酮、美迪紫檀素和甘草查尔酮A；防风1 个，为汉黄芩素；当归、白芍、防风与荆芥的共有成分1 个，为β-谷甾醇；黄芪与甘草的共有成分1 个，为刺芒柄花素；黄芪、甘草与荆芥的共有成分1 个，为槲皮素；黄芪、甘草与蒺藜的共有成分1 个，为异鼠李素；黄芪、甘草、蒺藜与白芍的共有成分1 个，为山奈酚。

图2 药物-活性成分-作用靶点-疾病网络

PPI 网络共包含120 个节点和2 247 条相互作用关系，利用2 倍DC 中位数，DC≥68 结合BC、CC、EC 中位数，BC≥28.362 871 31、CC≥0.573 497 306以及EC≥0.787 89 筛选网络得到核心PPI 网络，共有节点16 个，分别为基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、活瓣内切核酸酶-1（FN-1）、环氧化酶-2（PTGS-2）、表皮生长因子受体（EGFR）、表皮生长因子（EGF）、蛋白激酶B（AKT1）、白细胞介素-6（IL-6）、MMP2、IL-10、胱天蛋白酶3（Casp-3）、肿瘤坏死因子（TNF）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、IL-1B、肿瘤蛋白质53（TP53）、CXC 趋化因子配体-8（CXCL-8）以及信号转导和转录活化蛋白3（STAT-3），其中度中心性最高的有IL-6、AKT1 和VEGFA，分别可以与96、91、90 个蛋白发生相互作用，见图3。

图3 PPI 网络

2.4 分子对接结果 选取3 个核心靶点IL-6、AKT1、VEGFA 和网络中相应活性成分白藜芦醇、槲皮素、木犀草素进行分子对接，所得到的结果见表2、图4。其中最低结合能≤-5.0 kcal/mol 即表明药效分子与蛋白对接效果良好，结合能越低，表明分子与蛋白结合能力越佳。对接结果显示结合能均≤-5.0 kcal/mol，说明3 个靶蛋白与活性成分均有较好的结合力，且结合以上实验结果，与之结合的活性成分均为当归饮子治疗CSU 的核心成分。

图4 核心靶点与活性成分分子对接

表2 分子对接结果信息

2.5 GO 和KEGG 通路富集分析 在对药物-疾病共有靶点进行GO 和KEGG 富集分析后，共得到709 条结果，包括GO 结果596 条、KEGG 结果113条。本研究通过enrichment、P 值和富集到生物过程、通路上的基因个数来衡量GO 与KEGG 富集程度，其中enrichment 值表示差异表达的基因中位于该生物过程/通路条目的基因数目与该物种所有注释基因中位于该生物过程/通路条目的基因总数的比值，enrichment 越大，表示富集的程度越大。靶点关联的生物过程主要有细胞凋亡过程的负调控（27个靶点）、基因表达的正向调节（22 个靶点）、缺氧反应（18 个靶点）、一氧化氮生物合成过程的正向调节（12 个靶点）以及细胞增殖的正向调节（24 个靶点）等。共有靶点主要富集的通路有TNF 信号通路（20个靶点）、细胞凋亡信号通路（16 个靶点）、PI3K-Akt信号通路（30 个靶点）、HIF-1 信号通路（18 个靶点）、FoxO 信号通路（19 个靶点）及风湿性关节炎（16 个靶点）等，见图5、6。

图5 GO 富集分析

图6 KEGG 富集分析

3 讨论

本研究共得到当归饮子治疗CSU 的有效活性成分138 个，对应120 个疾病靶点，其中普遍存在一种活性成分对应多个疾病靶点，以及多种活性成分对应一个疾病靶点的关系，反应了当归饮子治疗CSU 多组分和多靶点的协同作用。

通过对药物-活性成分-作用靶点-疾病网络的筛选，预测出当归饮子在CSU 治疗中较重要的活性成分为：白藜芦醇、大黄素、木犀草素、7-O-甲基异丁香酚、黄芪紫檀烷、甘草甜素、柚皮素、驴食草酚、7-甲氧基-2-甲基异黄酮、美迪紫檀素、甘草查尔酮A、汉黄芩素、β-谷甾醇、刺芒柄花素、槲皮素、异鼠李素和山奈酚。白藜芦醇有抗氧化、抗炎的特性，并且可以调节细胞自噬功能[16]；木犀草素及柚皮素有很强的抗氧化、抗炎活性，可以降低小鼠体内高活性氧自由基（ROS）水平，从而在氧化应激方面改善CSU 症状，木犀草素还可以抑制IL-6、IL-17、TNF-α等各种促炎因子，以减轻机体过度的炎性反应[17-18]；山奈酚、槲皮素、异鼠李素等可以减少自由基生成，通过抑制氧化应激反应减轻机体损伤，还可以通过TNF、PI3K-Akt 等信号通路调节细胞生物学过程而发挥治疗作用[19-21]，其中山柰酚还可以通过调节VEGF 及其受体（VEGFR-2）以及下游信号转导通路PI3K-Akt 等对VEGF 刺激的血管内皮细胞生成有抑制作用[22]。以上各重要活性成分，多为黄酮类化合物，由此推测黄酮类化合物是当归饮子在CSU 中发挥治疗作用的主要活性成分。其可以通过PI3KAkt 信号通路、TNF 信号通路等多通路及抗炎、抗氧化、调节细胞自噬功能等多途径发挥对CSU 的干预作用。

通过对药物与疾病的交集靶点进行PPI 网络构建和筛选，共得到16 个关键靶点，例如IL-6、AKT1和VEGFA 等。IL-6 是与自身免疫密切相关的促炎细胞因子，也是CSU 炎性反应中其他促炎因子表达和抗体产生的基础因子，实验研究显示CSU 患者IL-6 水平明显高于健康对照，而在接受治疗后，IL-6水平也随之下降[23-25]。VEGFA 是VEGF 家族的成员，其表达产物是血管通透性的调节因子，主要由肥大细胞产生，在CSU 的炎性反应中起着重要作用[26-27]。有研究表示IL-6 可以单独诱导人皮肤肥大细胞产生VEGFA，在肥大细胞介导的血管生成中发挥作用[28]。而这一过程主要是通过PI3K-Akt-HIF-1-VEGF 轴实现的[26，29]。以上关键节点多涉及炎性反应、血管通透性的增加以及自身免疫等病理过程，这些也是CSU 的主要病理反应，据此推测，这可能是当归饮子对CSU 发挥治疗作用的关键所在。

分子对接结果显示槲皮素、木犀草素、白藜芦醇均能与上述3 个靶点的受体蛋白较稳定的自发结合，验证了此3 种活性成分作为当归饮子的核心药效成分。且由此可以推测，当归饮子可能通过其活性成分与疾病关键靶点蛋白发生相互作用而达到治疗CSU 的目的。

在对当归饮子治疗CSU 的靶点进行GO 和KEGG 富集分析后，发现共有靶点主要涉及CSU 发病机制中血管通透性的调节、炎性反应、氧化应激和细胞增殖与凋亡等生物过程[17，22-23，25-28]，以及TNF信号通路、PI3K-Akt 信号通路、HIF-1 信号通路和类风湿性关节炎等通路。根据文献报道，TNF 信号通路的激活与CSU 有关，是该疾病全身炎性反应的一部分，此外TNF 活性和其可溶性受体（sTNF-Rs）之间的平衡决定了机体免疫激活和炎性反应的过程，其失调可能在CSU 对药物的敏感性和耐药性中起作用[30-31]；有实验研究表示CSU 患者血清可通过PI3K-Akt 信号通路上调HIF-1α 的表达，激活下游HIF-1 信号通路，诱导肥大细胞表达VEGF 以调节血管通透性，从而导致CSU 的发病[26]；自身免疫也是引起CSU 的常见原因之一，包括IgE 抗体介导的针对自身抗原的Ⅰ型自身免疫反应和IgG 抗体介导的针对IgE 或FcεRI 的Ⅱ型自身免疫反应[32]。以上内容所涉及的生物学过程是CSU 发生发展的关键过程，综合GO 与KEGG 富集分析结果进一步表明了当归饮子多成分、多环节、多通路的整合作用机制。