潘欢 杨帆 戚维波 马兴杰

肺癌是我国最常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率均位居恶性肿瘤的第一位[1]。非小细胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）是肿瘤最常见的组织学类型，约占肺癌的80%～85%[2]。其中，肺腺癌又是NSCLC中最常见的病理组织亚型。由于肺腺癌具有高侵袭性、高早期转移率和高术后复发率等特点，所以患者的总体预后仍然不容乐观[3]。研究表明肿瘤的发生和发展是一个复杂的多步骤过程，包括抑癌基因失活、癌基因的激活、肿瘤细胞的增殖和凋亡失衡，最终导致肿瘤细胞的恶性增殖。即使在氧气充足的条件下，肿瘤细胞仍然倾向于将糖酵解作为其主要的能量代谢方式，这种现象被称为Warburg效应[4]。深入研究有氧糖酵解过程中的分子调控机制有助于发现新的肿瘤治疗靶点。本研究旨在探索泛素蛋白连接酶L3（ubiquitin conjugating enzyme E2 L3，UBE2L3）对肺腺癌细胞有氧糖酵解的影响，并初步研究UBE2L3调控有氧糖酵解的分子机制。

1 材料和方法

1.1 生物信息学分析 本研究生物信息学分析数据下载自肿瘤基因组图谱（the Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库（https://www.cancer.gov/tcga）。504例肺腺癌组织和59例正常肺组织列入本研究，比较肺腺癌组织和正常肺组织中UBE2L3蛋白表达水平。根据UBE2L3在肺腺癌组织中的表达中位值将肺腺癌组织分为UBE2L3高表达组和低表达组，运用R语言中的“survival”和“survminer”生存分析包分析UBE2L3 mRNA表达水平与肺腺癌患者总生存期的关系。根据肺腺癌组织中UBE2L3 mRNA表达水平的中位值将肺腺癌患者分为高表达组316例和低表达组188例，分析UBE2L3 mRNA表达水平对肺腺癌组织中有氧糖酵解水平的影响，即运用Spearman秩相关分析UBE2L3 mRNA表达水平与LDHA和PKM2 mRNA表达水平的相关性。

1.2 实验细胞、试剂和仪器 人肺腺癌细胞株HCC827和H1299均购自中国科学院上海细胞库。FBS购自美国Hyclone公司；RPMI 1640培养基购自美国Corning公司；UBE2L3过表达质粒、小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）质粒及阴性对照质粒均购自上海吉玛公司；胰酶、支原体检测试剂盒、苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonylfluoride or phenylmethylsulfonyl fluorid，PMSF）蛋白酶与磷酸酶抑制剂、细胞裂解液RIPA、BCA蛋白定量试剂盒、硝酸纤维素膜、脱脂奶粉、辣根过氧化物酶标记羊抗人的IgG、ECL化学发光显影液、磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-hydroxykinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，Akt）抑制剂Y294002、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）均购自中国上海碧云天生物技术有限公司；Lipofectamine 3000转染试剂购自美国Thermo Fisher公司；CCK-8试剂盒购自日本Dojindo公司；葡萄糖测定试剂盒、乳酸检测试剂盒均购自美国Sigma公司；UBE2L3抗体、M2-型丙酮酸激酶（pyruvate kinase M2，PKM2）抗体、L-乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase A，LDHA）抗体、Akt抗体、磷酸化 Akt（phosphorylated protein kinase B，p-Akt）抗体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体均购自美国Abcam公司。倒置荧光相差显微镜（型号：CKX53）购自日本Olympus公司；垂直电泳仪（Power Pac Basic）、蛋白转印模块（Mini TransBlot Cell）和凝胶成像系统（型号：BIORAD Gel Doc XR+）均购自美国Bio-Rad公司；CO2细胞培养箱、低温离心机（型号：Thermo Scientific MicroCL 21R）均购自美国Thermo Fisher公司；酶标仪（型号：ELX-800）购自美国Bio-Tek公司。

1.3 细胞培养 人肺腺癌细胞株HCC827和H1299均使用含10%FBS的RPMI 1640培养基培养于37℃、5%CO2培养箱中，隔天更换新鲜培养基。细胞定期检测有无支原体污染，当细胞融合度达到80%～90%时用胰酶消化传代。取对数生长期的细胞用于实验。

1.4 细胞转染 将实验分为两个部分。（1）UBE2L3过表达细胞：选择UBE2L3表达水平较低的HCC827细胞为研究对象，将对数生长期的细胞均匀铺于6孔板中，待细胞融合度达到60%～70%时采用Lipofectamine 3000转染试剂，按说明书进行转染操作，分别将UBE2L3过表达质粒以及阴性对照质粒转染到细胞中，转染48 h后，荧光显微镜下观察细胞的转染效率，构建UBE2L3过表达质粒细胞HCC827/UBE2L3及阴性对照细胞HCC827/NC，收集细胞用于后续实验。（2）UBE2L3敲低细胞：选择UBE2L3表达水平较高的H1299细胞为研究对象，如上述方法铺板，再分别将siRNA质粒以及阴性对照质粒转染到细胞中，转染48 h后，荧光显微镜下观察细胞的转染效率，构建UBE2L3敲低细胞H1299/si-UBE2L3及阴性对照细胞H1299/si-NC，收集细胞用于后续实验。

1.5 细胞增殖能力检测 采用CCK-8法。将上述转染成功的细胞接种于96孔板中，每孔加入100 μl细胞悬液（含3×103个细胞）。每组设置5个复孔，分别于0、24、48、72、96 h加入10 μl CCK-8溶液，于培养箱中37℃孵育4 h。采用酶标仪测定450 nm波长处的吸光度（optical density，OD）值，并绘制细胞生长曲线。

1.6 细胞中葡萄糖消耗量检测 采用葡萄糖测定试剂盒。严格按照试剂盒操作说明书配置工作液。将上述转染成功的细胞和工作液加入96孔板中，并设置3个复孔。置于37℃培养箱中孵育30 min。取出96孔板，去除气泡后置于酶标仪上检测630 nm波长处的OD值，绘制葡萄糖消耗量曲线，计算细胞中葡萄糖消耗量。

1.7 细胞中乳酸生成量检测 采用乳酸检测试剂盒。收集上述转染成功的细胞培养基上清液2 ml，加入1 ml酶工作液，置于37℃培养箱中孵育10 min，随后加入终止液22 ml终止酶促反应。将上清混合液加入96孔板中，置于37℃培养箱中培养30 min。取出96孔板，使用酶标仪测定490 nm波长处的OD值，计算细胞中乳酸生成量。

1.8 UBE2L3、有氧糖酵解相关蛋白PKM2、LDHA表达水平检测 采用Western blot法。使用含1%PMSF蛋白酶抑制剂的细胞裂解液RIPA裂解上述转染成功的细胞。置于冰上均匀摇晃15 min后，采用细胞刮子收集裂解液。裂解液于4℃、12 000 g离心15 min，收集上清液采用BCA法测定蛋白浓度。加入蛋白缓冲液调节蛋白浓度，于100℃沸水中水浴5 min使其蛋白变性，将蛋白裂解液置于-80℃冰箱备用。每孔加入30 μg蛋白样品，经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳并转移至硝酸纤维素膜上。将整张膜浸泡5%脱脂奶粉常温封闭1 h，加入UBE2L3（1∶1 000）抗体、PKM2（1∶1 000）抗体、LDHA（1∶1 000）抗体、Akt（1:1 000）抗体、p-Akt抗体和GAPDH（1∶2 000）抗体于4℃下摇床过夜孵育。PBST缓冲液洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的二抗，常温孵育1 h。采用化学发光显影液发光，在成像系统中扫描并分析结果。使用Image J软件计算各个条带的灰度值，即蛋白表达水平。

1.9 PI3K/Akt抑制剂对HCC827/UBE2L3细胞的有氧糖酵解的影响 将上述转染成功后的HCC827/UBE2L3细胞，分别加入PI3K/Akt抑制剂Y294002（1.5 μmol/L）（HCC827/UBE2L3+LY）及DMSO（1.5 μmol/L）作为阴性对照（HCC827/UBE2L3+DMSO）。细胞培养24 h后，收集细胞，上述方法检测细胞增殖能力、葡萄糖消耗量、乳酸生成量及UBE2L3、有氧糖酵解相关蛋白PKM2、LDHA表达水平。

1.10 统计学处理 采用SPSS 25.0统计软件。计量资料组间比较采用两独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺腺癌组织和正常肺组织中UBE2L3蛋白表达水平比较 生物信息学分析提示，肺腺癌组织中UBE2L3蛋白表达水平高于正常肺组织（P＜0.05），见图1。

图1 肺腺癌组织和正常肺组织中UBE2L3蛋白表达水平比较

2.2 不同UBE2L3表达水平肺腺癌患者总生存期的比较 UBE2L3高表达组患者总生存期低于低表达组（P＜0.05），见图2。

图2 不同UBE2L3表达水平肺腺癌患者总生存期的比较

2.3 UBE2L3 mRNA表达水平对肺腺癌组织中有氧糖酵解水平的影响 肺腺癌组织中UBE2L3 mRNA表达水平升高，同时LDHA和PKM2 mRNA表达水平也随着升高。UBE2L3 mRNA表达水平与LDHA和PKM2 mRNA表达水平均呈正相关（r=0.258和0.404，均P＜0.01），见图3。

图3 UBE2L3 mRNA表达水平对肺腺癌组织中有氧糖酵解水平的影响（A：肺腺癌组织中UBE2L3 mRNA表达水平与LDHA mRNA表达水平相关性分析的散点图；B：肺腺癌组织中UBE2L3 mRNA表达水平与PKM2 mRNA表达水平相关性分析的散点图）

2.4 UBE2L3表达水平对肺腺癌细胞增殖能力的影响 HCC827/UBE2L3组细胞在48、72、96 h时增殖能力均高于HCC827/NC组（均P＜0.05），见图4A。H1299/si-NC组细胞在48、72、96 h时增殖能力均高于H1299/si-UBE2L3组（均P＜0.05），见图4B。

图4 UBE2L3表达水平对肺腺癌细胞增殖能力的影响（A：HCC827/UBE2L3组和HCC827/NC组细胞不同时点增殖能力比较；B：H1299/si-UBE2L3组和H1299/si-NC组细胞不同时点增殖能力比较）

2.5 UBE2L3表达水平对肺腺癌细胞中葡萄糖消耗量与乳酸代谢的影响 有氧糖酵解实验结果显示，HCC827/UBE2L3组细胞葡萄糖消耗量大于HCC827/NC组，H1299/si-UBE2L3组细胞葡萄糖消耗量小于H1299/si-NC组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图5A。HCC827/UBE2L3组细胞乳酸生成量大于HCC827/NC组，H1299/si-UBE2L3组细胞乳酸生成量小于H1299/si-NC组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图5B。

图5 UBE2L3表达水平对肺腺癌细胞中葡萄糖消耗量与乳酸代谢的影响（A：不同组间葡萄糖消耗量比较；B：不同组间乳酸生成量比较）

2.6 UBE2L3表达水平对肺腺癌细胞中有氧糖酵解相关蛋白表达的影响 HCC827/UBE2L3组细胞PKM2和LDHA蛋白表达水平明显高于HCC827/NC组，而H1299/si-UBE2L3组细胞PKM2、LDHA蛋白表达水平明显低于H1299/si-NC组，见图6。

图6 UBE2L3 表达水平影响肺腺癌细胞有氧糖酵解相关蛋白表达的电泳图

2.7 UBE2L3表达水平对PI3K/Akt信号通路蛋白表达的影响 过表达UBE2L3后，HCC827/UBE2L3组细胞p-Akt蛋白表达水平明显高于HCC827/NC组，而两组细胞Akt表达水平无明显变化；H1299/si-UBE2L3组细胞p-Akt蛋白表达水平低于H1299/si-NC组，而两组细胞Akt表达水平无明显变化，见图7。

图7 UBE2L3表达水平影响PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达的电泳图

2.8 PI3K/Akt抑制剂对UBE2L3的有氧糖酵解的影响 经过抑制剂Y294002处理HCC827/UBE2L3细胞后，Akt活性被抑制，p-Akt、LDHA和PKM2蛋白表达水平均下降，见图8A。同样，细胞增殖实验结果提示，经过抑制剂处理后的HCC827/UBE2L3细胞增殖能力较HCC827/UBE2L3+DMSO组下降，见8B。通过有氧糖酵解实验可以看出，经过抑制剂处理后的HCC827/UBE2L3细胞葡萄糖消耗量较HCC827/UBE2L3+DMSO组明显下降，见8C。乳酸生成量检测结果也可以看出，经过抑制剂处理后的HCC827/UBE2L3细胞乳酸生成量较HCC827/UBE2L3+DMSO组明显下降，见图8D。

图8 PI3K/Akt抑制剂对UBE2L3的有氧糖酵解的影响（A：HCC827/UBE2L3细胞中加入抑制剂后p-Akt、PKM2和LDHA蛋白表达的电泳图；B：加入抑制剂后对HCC827/UBE2L3细胞增殖的影响；C：加入抑制剂后对HCC827/UBE2L3细胞葡萄糖消耗量的影响；D：加入抑制剂后对HCC827/UBE2L3细胞乳酸生成量的影响）

3 讨论

在有氧条件下，正常细胞通过线粒体氧化磷酸化提供能量，而肿瘤细胞通过糖酵解途径产生绝大部分维持生存和快速增殖的能量，该现象被称为Warburg效应或有氧糖酵解[5]。癌细胞代谢重编辑被认为是恶性肿瘤的十大重要特征之一[6]。糖酵解使得肿瘤细胞在即使缺氧的条件下也能存活下来，并为肿瘤细胞提供快速增殖所需的能量。同时糖酵解过程中产生的酸性环境有利于肿瘤细胞的迁移和侵袭，增加肿瘤远处转移率[7-8]。因此肿瘤的有氧糖酵解过程是近年来肿瘤领域的研究热点。尽管Warburg效应的发现已有很长一段时间，但其具体调控机制仍然尚不清楚。深入研究有利于探索新的肿瘤治疗靶点，改善肿瘤患者的生存预后。

UBE2L3是泛素结合酶家族成员之一，越来越多的研究表明UBE2L3的异常表达参与了多种肿瘤的发展过程。在肝癌中，UBE2L3促进肝癌细胞的增殖和转移[9-10]。在前列腺癌中，UBE2L3参与调控上皮-间充质细胞转化过程，并且发挥癌基因的作用[11]。在宫颈癌中，UBE2L3参与调控顺铂化疗耐药的分子机制[12]。之前研究报道UBE2L3在肺腺癌组织中异常高表达，且与不良临床病理特征有关[13]。体内外实验均表明，UBE2L3能够显著增强肺腺癌细胞的增殖能力。UBE2L3通过SCF（Skp2）泛素连接酶复合物促进p27kip1的泛素化降解调控细胞周期进程[13]。然而，UBE2L3是否参与肺腺癌的有氧糖酵解过程尚不清楚。葡萄糖消耗量和乳酸生成量是最常用的检测糖酵解活性的指标。同时糖酵解过程受到LDHA和PKM2等关键蛋白酶的限速调控。因此，检测细胞糖酵解关键酶的表达量也能够检测糖酵解的活性。本研究中，在HCC827细胞中过表达UBE2L3能够显著增加细胞对葡萄糖的消耗和乳酸的产量，同时提高糖酵解相关蛋白PKM2和LDHA蛋白的表达水平。而在H1299细胞中UBE2L3沉默能够抑制细胞对葡萄糖的消耗和乳酸的产量，降低PKM2和LDHA蛋白的表达量。因此，UBE2L3参与了肺腺癌有氧糖酵解过程。

肿瘤中通常存在PI3K/Akt信号通路异常活化，参与多种恶性生物学过程，尤其是激活的PI3K/Akt信号通路能够增加肿瘤细胞对葡萄糖的摄取和糖酵解相关基因的表达，从而促进肿瘤细胞的糖酵解过程[14-16]。深入研究发现，过表达UBE2L3显著增加p-Akt蛋白的表达；敲低UBE2L3后p-Akt蛋白水平降低。为了进一步验证UBE2L3通过激活PI3K/Akt信号通路参与有氧糖酵解过程，采用PI3K/Akt抑制剂LY294002阻断PI3K/Akt信号通路。UBE2L3过表达细胞中加入PI3K/Akt信号通路抑制剂Y294002处理后，葡萄糖消耗量和乳酸生成量明显减少，而PKM2和LDHA蛋白表达水平下降。并且Y294002处理后HCC827/UBE2L3细胞的增殖能力明显受到抑制。因此，UBE2L3可能参与激活PI3K/Akt信号通路从而促进有氧糖酵解过程，以此增加肺腺癌的恶性增殖。

综上所述，本研究证实UBE2L3能够通过激活PI3K/Akt信号通路促进肺腺癌葡萄糖的摄取，增强糖酵解过程，促进肺腺癌恶性增殖，为深入研究肺腺癌的发病机制提供了新的线索。