何子毅 胡应明 崔四平 许先国

ABO血型鉴定的准确性是输血安全的重要保障。在临床工作中经常会遇到一些ABO血型鉴定正反定型不一致的情况，常导致临床输血延迟，也给输血科完成血型鉴定及交叉配血带来不少的麻烦。本实验室在日常送检的血样本中发现了1例B（A）血型，但该血型用血清学鉴定常被误定为A2B型或A亚B型；该类血型罕见，在高加索人群大约为1/580 000～1/170 000[1]，我国还没有非常准确的数据报道。本次发现的ABO*BA.02/O.01.02型尚未见在国外有报道，但在国内有极少的个案报道[2-3]。我们对本例血样本进行了血型血清学和基因测序，报道如下。

对象与方法

1对象 患者，女，45岁，籍贯四川省富顺县。2021年4月21日，因“胆囊结石”入我市某医院外科行胆囊取石术，医院检验科因ABO血型正反定型不一致，最终不能确定ABO血型而送检至本实验室。

2试剂与仪器 单克隆抗-A1、单克隆抗-H试剂、红细胞不规则抗体筛选细胞、红细胞不规则抗体鉴定谱细胞均为上海血液生物医药有限责任公司产品；单克隆抗-A、抗-B、抗-AB为长春博迅生物技术有限公司产品；微柱凝胶卡为西班牙Daina公司产品，聚凝胺试剂盒为上海血液生物医药有限责任公司产品，人ABO血型反定型试剂红细胞为本实验室自制（通常为5～6人份红细胞混合），核酸提取试剂盒由芮宝生医药股份有限公司提供。主要仪器：KA-2200型血型血清学专用离心机（日本KUBOTA公司）、微柱凝胶卡专用离心机和孵育器（西班牙Daina公司），Magcore HF48型核酸提取仪（芮宝生医药股份有限公司），PCR扩增仪（美国ABI公司），3730基因测序仪（美国ABI公司）及其机带测序软件Seqscap V2.5。

3血型血清学方法 试管法进行ABO血型鉴定、红细胞不规则抗体筛选和不规则抗体鉴定，聚凝胺法及微柱凝胶法进行IgG型抗体鉴定。试验方法按照《全国临床检验操作规程》（第4版）执行。微柱凝胶法操作按产品使用说明书进行，其他试验均执行本实验室的标准操作规程。

4基因组DNA抽提 采用自动核酸提取仪抽提，严格按照试剂说明书进行操作，标本DNA浓度为50 ng/µL，A260/280比值为1.80。

5ABO血型基因分型 ABO全部外显子编码区序列分析操作参照文献[4]：采用3对特异性引物分别扩增ABO等位基因的第6，7外显子序列。扩增产物进行酶切纯化后，采用Big Dye Terminator v3.1 cycle sequencing试剂进行测序。测序电泳在ABI3730DNA测序仪上进行，测序结果用SeqScape V2.5软件进行序列分析（参考序列为GenBank中ABO基因序列，登记号为NG_006669.1），最终依据碱基情况判定标本基因型。ABO等位基因命名原则参照国际输血协会红细胞免疫遗传和血型命名委员会的标准。

结果

1血型血清学结果 患者ABO血型鉴定：正定型为AB型，A抗原凝集强度“2+”，明显弱于正常A抗原，与单克隆抗-A1未凝集，提示为A2亚型或其他亚型；红细胞与单克隆抗-B和单克隆抗-H凝集强度均“4+”；血浆与试剂红细胞Ac、Oc有弱凝集，与Bc细胞无凝集，4℃条件下与常温下相比较各反应管没有明显的增强。患者红细胞不规则抗体筛选在盐水介质呈阳性，进一步用盐水介质法进行抗体特异性鉴定，检出抗-M，经聚凝胺法和微柱凝胶法进行不规则抗体筛选未发现存在IgG型红细胞不规则抗体。选用M抗原阴性的Ac和Oc进行反定型试验，结果与M抗原（-）的Ac仍有“1+”凝集反应，与M抗原（-）的Oc无凝集，说明患者血浆中存在抗-A1，结果见表1。

表1 血型血清学鉴定结果

2ABO基因检测结果 对ABO基因的第6和第7外显子直接测序发现，存在c.261delG、c.297A＞G、c.526C＞G、c.646T＞A、c.657C/T、c.681G＞A、c.700C＞G、703G＞A、c.771C＞T、c.796C＞A、c.803G＞C、c.829G＞A、c.930G＞A，与ABO*A1.01标准序列对比，发现存在突变基因c.700C＞G（图1），确定该献血者为B（A）/O 02杂合，基因型为ABO*BA.02/O.01.02。

图1 ABO基因第6第7外显子测序部分图（其中c.700C＞G是国内罕见报道）

讨论

上海血液中心于2004年在国内首次报道了B（A）血型[2]。在国外，YAMAMOTO等最早发现并报道了B（A）血型[5]。B（A）血型在血清学和遗传学分类上归属于B型，且是罕见的B亚型。已报道在欧洲高加索人群中B（A）血型的频率约为1/（17～58）万[1]，我国献血人群B（A）血型频率大约为1/（5～10）万[6]，上海血液中心曾报道B（A）02的发生频率为0.78/10万[7]。已报道的B（A）分型共有6种，为B（A）01～06。国内鲜见报道的B（A）型分型为B（A）02（c.700C＞G）、B（A）04（c.640A＞G）以及B（A）05（c.641T＞C）［2-3，8］。B（A）04和B（A）02血型是我国大陆B（A）血型报道的主要类型。

血型血清学方法在ABO血型鉴定存在局限性，有些血型的变异型可能会被误判，造成血型血清学与分子生物学定型结果不一致，也存在技术操作者对血型血清学中强弱凝集程度判断标准认知有差异。B（A）血型常因红细胞上检出A抗原，在血型血清学定型为A亚B型。实际上B（A）血型与A亚B型在血清学特点上有一定区别：B（A）型正定型与单克隆抗-A1不凝集，与一些单克隆抗-A及人源性抗-A发生弱凝集，与抗-B强凝集（4+），与抗-H多数情况下发生强凝集，反定型血清中含有正常的抗-A、与A1细胞发生凝集，也可以凝集A2细胞；而A亚B血型正定型与单克隆抗-A呈较强凝集，与抗-H呈弱凝集，反定型血清中可能检出不规则抗-A1、与A1细胞呈弱凝集反应。ABO亚型主要是由于控制糖基转移酶表达的ABH基因第6和/或第7外显子基因位点发生了变异，分子基础与4个氨基酸的关键位置（G526C、A703G、A796C、C803G）密切相关，通常将A糖基转移酶描述为AAAA，B糖基转移酶为BBBB，那么B（A）的糖基转移酶可能是BABB或BBBB[9-11]。B（A）血型的形成机理是B等位基因在正常B基因序列上发生单碱基变异，变异后的B基因可能具有编码A糖基转移酶和B糖基转移酶双功能活性，从而在血清学方法中既表现B抗原特异性，又表现少量A抗原特异性[12]。

本例血样本经ABO血型鉴定后发现弱A抗原表达，且与抗-A1不反应，而B抗原和H抗原有强凝集反应，反定型存在抗-A1，初步推测为A2B型或A亚B，由于存在强凝集的H抗原，也可能为B（A）血型。由于该患者为外地务工人员，无法开展家系调查，基因测序分析后发现该血样本的B等位基因在第700位核苷酸发生了C＞G的单碱基突变，可能导致第234位氨基酸由Pro（脯氨酸）到Ala（丙氨酸）的改变，导致266位甲硫氨酸和268位丙氨酸的空间构象发生变化，使糖基转移酶特性发生改变[13-14]，从而具有了编码双功能酶活性的能力。因此，B（A）02又称为B（A）700（526C/G，c.700C＞G，703G/A，796C/A，803G/C，BBBB）。

B（A）血型患者若进行输血治疗时，应根据病情选择O型洗涤红细胞或AB型血浆。若献血者或患者为B（A）血型，条件允许的情况下应进行家系调查，并进行分子生物学分析，结合血型血清学准确鉴定血型，进一步保障输血安全。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突