王之丰 孙昊 胡电 金志军 刘晓军

卵巢癌的发病率低于宫颈癌和子宫内膜癌，居妇科恶性肿瘤的第三位，但死亡率却超过宫颈癌及子宫内膜癌之和，居妇科癌症首位，是严重威胁妇女健康的最大疾患[1-2]。由于卵巢癌的症状不典型，容易被归为其他疾病的并发症，“无声的杀手”因此得名。临床上缺乏有效的筛查技术，因此卵巢癌通常在晚期才被诊断出来，预后较差[3-4]。目前，卵巢癌的治疗依赖于手术和铂类药物，但肿瘤在腹腔内和盆腔内的种植转移无法控制。最新研究显示，卵巢癌5年后的存活率仅为48.6%[2，5]。因此，迫切需要开发新的诊断指标和预后治疗靶标来优化治疗方案。

lncRNAs是一种调节性的非编码RNA，其异常调控被认为与许多疾病有关。miRNAs在不同类型的肿瘤中起着抑癌或癌基因的作用[6]，而lncRNAs常常作为miRNAs间接调控基因表达的靶点。大量研究表明，miRNAs与lncRNAs之间的相互作用能较大程度影响癌症的发生和发展[7]。因此，建立一种有效的方法来鉴定与癌症相关的lncRNA-miRNA相互作用是非常重要的。竞争性内源RNA（CeRNA）假说的提出让人们对lncRNA-miRNA之间作用机制的认识上升到一个新的层面[8]。至今已有许多报道证实lncRNAs ABHD11-AS1对卵巢癌的进程有促进作用，但作用机制还有待进一步的探究[9]。而值得关注的是lncRNAs ABHD11-AS1存在miR-133a的结合位点[10]，而miR-133a是否通过介导ABHD11-AS1信号从而影响卵巢癌的进程目前还没有相关研究。故本研究旨在探究miR-133a能否通过介导ABHD11-AS1信号影响卵巢癌的进展，并深入分析其作用机制。

材料与方法

1细胞株 人卵巢癌细胞TOV-112D和CaVO3购自中国科学院上海细胞库。人输卵管上皮细胞TEC购自上海钰博生物科技有限公司。所有细胞均使用42.5%MCDB105（含1.5 g/L碳酸氢钠）+42.5% M199（含2.2 g/L碳酸氢钠）培养液中，同时加入15%胎牛血清以及1%的青霉素-链霉素培养。并将细胞置于37 ℃、5% CO2的培养箱内培养，常规消化传代，选用对数生长期的细胞进行实验。

2主要试剂 PRMI-1640培养液购自HyClone公司；胎牛血清购自Gibco；RIPA裂解液和BCA试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；NC siRNA，lncRNAsABHD11-AS1 siRNA，NC siRNA inhibitor、miR-133a inhibitor以及NC mimic和miR-133a mimic委托上海合星生物科技有限公司合成；Lipofectamine 2000转染试剂购自Invitrogen公司；TRLzol试剂以及TIANSeq M-MLV反转录酶购自北京普洛麦格生物技术有限公司；SYBR Green qPCR Mix购自于Thermo Fisher Scientific公司；CCK-8检测试剂购自北京索莱宝公司；pMIR-reporter荧光素酶载体购自美国Ambion 公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自于北京索莱宝公司。

3Real-time PCR 采用TRIzol试剂按照说明书从细胞中分离出总RNA。然后按照操作说明书通过TIANSeq M-MLV逆转录成cDNA。采用SYBR Green qPCR Mix进行Real-time PCR反应，控制条件在95℃ 10 min;95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 10 s下利用SYBR Green qPCR Mix进行Real-time PCR反应，经历35个循环后检测其溶解曲线并分析样本Ct值。以GAPDH为内参，采用2-△△Ct法计算mRNA的相对表达量。实验中所用引物序列见表1。

表1 Real-time PCR引物序列

4免疫印迹分析 在冰上用预冷后的RIPA裂解液裂解细胞。使用BCA试剂盒对细胞总蛋白进行定量，操作严格按照说明书进行。每组总蛋白上样量为20 μg，再用10%聚丙烯酰胺凝胶进行分离，最后转移到PVDF膜上。在室温下用5%脱脂牛奶封闭1.5 h后，用以下主要抗体在4 ℃下培养过夜：小鼠单克隆抗人β-actin antibody（1∶3 000；Cell Signaling Technology），小鼠单克隆抗人EGFR（1∶1 500；Cell Signaling Technology）。用PBS冲洗膜5次，每次5 min，并在室温下用辣根过氧化物酶（HRP）结合的山羊抗鼠IgG（1∶5 000；Santa Cruz Biotechnology）培养2 h。用化学发光（ECL）检测系统检测条带，并用image-j软件对结果进行分析。

5细胞转染 将对数生长期的细胞接种于6孔板中，待细胞增长到70% 融合时，采用Lipofectamine 2000转染试剂进行细胞转染，按照试剂盒说明书转染NC siRNA、ABHD11-AS1 siRNA和NC inhibitor、miR-133a inhibitor或者NC mimic和miR-133a mimic。ABHD11-AS1 siRNA的序列为：Forward：5'-GCUACGAGAUCAUGAGCCA-3'，Reverse：5'-UGGCUCAUGAUCUCGUAGC-3'。

6CCK-8实验 将细胞接种至96孔板，每孔的密度为1.0×103/孔。分别于细胞转染后的 0、24、48、72和96 h时加入10 μL的CCK-8试剂。2 h后用酶标仪测量OD450值。

7双荧光素酶检测 将含有ABHD11-AS1野生型序列的质粒wt-ABHD11-AS1和突变型序列的质粒mut-ABHD11-AS1分别与miR-133a mimic或者NC mimic共转染至TOV-112D细胞内，24 h后采用双荧光素酶报告的基因检测试剂盒检测各组的荧光强度。以荧光素酶pGL-3.0为内参，分析各组荧光素酶的活性。

8统计学分析 数据分析主要用GraphPad Prism 8.0和SPSS17.0软件进行。两样本的比较采用独立样本的t检验分析，三组及以上的差异分析则利用单因素方差分析，事后比较采用LSD法。当P＜0.05时，差异具有统计学意义。

结果

1lncRNAs ABHD11-AS1对卵巢癌细胞增殖的影响Real-time PCR检测lncRNAs ABHD11-AS1在卵巢癌细胞TOV-112D和CaVO3和人输卵管上皮细胞TEC中的表达，结果显示：ABHD11-AS1在TOV-112D和CaVO3中的表达水平明显高于TEC细胞。为了探究lncRNAs ABHD11-AS1的表达水平对卵巢癌细胞增殖影响，在TOV-112D和CaVO3细胞中转染ABHD11-AS1 siRNA，运用CCK-8实验进行检测，结果表明：下调lncRNAs ABHD11-AS1表达水平可明显抑制卵巢癌细胞的增殖（图1，P＜0.01）。

图1 Real-time PCR检测lncRNAsABHD11-AS1在卵巢癌细胞和人输卵管上皮细胞中的表达

2lncRNAs ABHD11-AS1对miR-133a的调控作用 在转染ABHD11-AS1 siRNA后，用Real-time PCR检测CaVO3和TOV-112D中的miR-133a的表达。一方面，从图2A（Real-time PCR）可以看出在CaVO3和TOV-112D中转染ABHD11-AS1 siRNA后，miR-133a的表达明显升高（P＜0.01）。另一方面，图2B（双荧光素酶）结果表明，转染miR-133a mimic和野生型lncRNAs ABHD11-AS1后的细胞荧光强度显著降低（P＜0.01）。因此，上述结果说明lncRNAsABHD11-AS1参与调控miR-133a的表达。

图2 lncRNAs ABHD11-AS1对miR-133a的调控

3miR-133a在卵巢癌细胞系和人输卵管上皮细胞TEC中的表达情况 Real-time PCR检测卵巢癌细胞系TOV-112D、CaVO3和人输卵管细胞TEC中miR-133a的表达，结果显示：相对于TEC细胞，miR-133a在TOV-112D和CaVO3中的表达水平显著降低（图3），在TOV-112D和CaVO3细胞中分别转染NC mimic和miR-133a mimic，Real-time PCR结果（图3）显示：与NC mimic组相比，在转染了miR-133a mimic后的TOV-112D和CaVO3细胞中miR-133a的表达水平会明显增加（P＜0.01）。转染miR-133a mimic能够显著增加TOV-112D和CaVO3细胞中miR-133a的表达水平。

图3 miR-133a在卵巢癌细胞系和人输卵管上皮细胞TEC中的表达

4miR-133a对卵巢癌细胞增殖的影响 在得出上述结论后，我们进一步探究了miR-133a的表达水平对卵巢癌细胞增殖的影响。首先对TOV-112D和CaVO3细胞进行转染miR-133a mimic并培养24 h，随后用CCK-8检测二者的增殖能力，结果显示转染后细胞的增殖能力降低（图4，P＜0.01），说明上调miR-133a的表达有利于抑制卵巢癌细胞的增殖。根据上述结果，进一步探究miR-133a与卵巢癌细胞增殖的关系，在TOV-112D和CaVO3细胞中转染miR-133a inhibitor，结果表明：下调miR-133a表达水平可明显促进卵巢癌细胞的增殖（图5，P＜0.01）。

图4 miR-133a对卵巢癌细胞TOV-112D和CaVO3增殖的影响

图5 miR-133a inhibitor 对卵巢癌细胞增殖的检测

5卵巢癌细胞中miR-133a下游靶基因EGFR的表达检测 在TOV-112D和CaVO3细胞中转染miR-133a mimic后，检测下游靶基因EGFR的表达，结果显示：与NC mimic组相比，转染miR-133a mimic后两株细胞中EGFR的表达水平显著降低，差异具有统计学意义（图6，P＜0.01）。此外，为了进一步探究miR-133a与卵巢癌细胞中EGFR表达的关系，在前期研究基础上，在TOV-112D和CaVO3细胞中转染miR-133a inhibitor，结果表明：与NC inhibitor组相比，转染miR-133a inhibitor后两株细胞中EGFR的表达水平明显提高，差异具有统计学意义（图7，P＜0.01）。

图6 miR-133a mimics对卵巢癌细胞EGFR表达的检测

图7 miR-133a inhibitor对卵巢癌细胞EGFR表达的检测

6卵巢癌细胞中蛋白EGFR的表达检测 在TOV-112D和CaVO3细胞中转染miR-133a mimic后检测下游蛋白EGFR的表达，结果显示：与NC mimic组相比，转染miR-133a mimic能够显著降低两株细胞中EGFR的表达水平，差异具有统计学意义（图8，P＜0.01）。与此相反，在TOV-112D和CaVO3细胞中转染miR-133a inhibitor，结果表明：与NC inhibitor组相比，转染miR-133a inhibitor后细胞中EGFR的表达水平明显提高，差异具有统计学意义（图9，P＜0.01）。

图8 miR-133a mimics对下游蛋白EGFR的表达检测

图9 miR-133a inhibitor对下游蛋白EGFR的表达检测

7lncRNAsABHD11-AS1的表达水平对EGFR表达的影响 根据上述结果，为了探究lncRNAs ABHD11-AS1的表达水平对EGFR表达的影响，在TOV-112D和CaVO3细胞中转染ABHD11-AS1 siRNA，运用Real-time PCR以及WB实验进行检测，结果表明：与NC siRNA组相比，转染ABHD11-AS1 siRNA后细胞中EGFR的表达水平明显降低，差异具有统计学意义（图10，P＜0.01）。

图10 Real-time PCR和WB实验检测ABHD11-AS1 siRNA对EGFR表达的影响

讨论

miRNAs作为一种小分子非编码RNA，其长度约21～25个核苷酸，能够结合目的基因的3'非编码区（3'UTRs）来抑制基因表达[8]。由于一个miRNA靶向多个mRNA，因此miRNA在众多生物学过程中发挥着重要作用，如细胞增殖、血管生成、细胞周期和细胞迁移等。研究表明miRNAs的改变影响着肿瘤的发展，miRNAs在肿瘤中异常表达，并且由于其靶点的性质miRNAs起着肿瘤启动子或抑制子的作用[11]。多个miRNAs已经被证实能够调控卵巢癌细胞的增殖，并调节肿瘤的发生进展与转移，其中，miR-133a在卵巢癌的发病和转移的过程中起着至关重要的作用[12-13]。与此类似，lncRNA作为一种长度大于200个核苷酸的非编码RNA。研究表明其与各种疾病尤其是肿瘤有着密不可分的联系，正逐步成为研究热点[14]。ceRNA假说指出lncRNA可以通过miRNA的结合位点吸附miRNA从而释放miRNA下游的靶基因[8]。研究表明，lncRNAsABHD11-AS1通过调控miR-361-3p/PDPK1信号促进胃癌的发展[15]，亦有研究证实，其靶向细胞周期蛋白D1促进子宫内膜癌的发展[16]，皆表明其与肿瘤密不可分。LEI等通过生物信息学预测发现lncRNAsABHD11-AS1上存有miR-133a的结合位点[10]，且有实验证实了该结合位点的可行性[17-18]。而且我们的实验结果更进一步证实，在卵巢癌细胞中下调ABHD11-AS1显著促进了miR-133a的表达，双荧光素酶结果显示，同时转染miR-133a mimic和野生型ABHD11-AS1的片段显著抑制了荧光素酶的活性。上述结果说明ABHD11-AS1能够与miR-133a结合。

miR-133a首次被报道是一项在小鼠上进行的试验研究，研究发现miR-133a通过调节骨形态发生蛋白2（BMP-2）在胚胎肌肉发育过程中对成肌细胞增殖和分化起着至关重要的作用[19-20]。肿瘤细胞与正常细胞最大的区别是肿瘤细胞过度增殖的生长特性，随着对miR-133a进一步的研究，人们发现miR-133a在前列腺癌[21]、头颈部鳞状细胞癌[22]、乳腺[23]、膀胱[24]、食管[25]和结直肠肿瘤[26]中的表达与正常组织相比相对下调。研究表明miR-133a表达的恢复被报道可以抑制癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并诱导肿瘤细胞凋亡[21-26]。这些证据都表明miR-133a在多种人类癌症中起抑癌作用。我们的研究也验证了这一点：上调miR-133a能显著抑制卵巢癌细胞的增殖能力，且抑制miR-133a的表达水平会促进其增殖。再结合lncRNAs ABHD11-AS1在卵巢癌组织中的高表达以及抑制ABHD11-AS1的表达能够显著抑制卵巢癌细胞的增殖[9]的研究发现，可以推测下调lncRNAs ABHD11-AS1能够释放miR-133a来抑制卵巢癌细胞的增殖，我们的研究也证实了这一点，通过下调lncRNAs ABHD11-AS1的表达水平，可以明显抑制卵巢癌细胞的增殖以及EGFR的表达水平。

众所周知，miRNAs通常通过与靶mRNAs的3'utr结合抑制靶mRNAs的表达来发挥其生物学功能。SONG等人[27]通过生物信息学的方法预测miR-133a的基因靶点发现表皮生长因子受体（EGFR/ErbB-1/HER1）在3'UTR上有两个高度保守的miR-133a结合位点，miR-133a能够靶向调控EGFR来抑制宫颈癌细胞在体内增殖。研究发现miR-133a通过直接靶向非小细胞肺癌[28]、前列腺癌[29]和乳腺癌[30]中的3'UTR抑制EGFR的表达。EGFR是表皮生长因子（EGF）成员的细胞表面受体，是ErbB受体家族的一员，在刺激细胞内蛋白酪氨酸激酶[31]活性方面起着关键作用。据报道，EGFR在多种肿瘤呈高表达，并且EGFR的过度表达与肿瘤的进展、对化疗和放疗的抵抗以及预后不良有关，表明它是一种癌基因[32]。我们的研究显示，上调miR-133a显著抑制卵巢癌细胞中EGFR的表达，在抑制miR-133a的表达水平后发现此抑制作用被逆转，这提示了miR-133a可能通过抑制EGFR的表达来发挥抗卵巢癌细胞增殖的作用。

综上，本研究主要探讨了卵巢癌细胞中miR-133a的表达水平对抗癌作用的影响，并深入研究了其作用机制。结果表明，相对于人输卵管上皮细胞，miR-133a在卵巢癌细胞中的表达水平更低，而上调其表达则有利于抑制卵巢癌细胞的增殖能力，通过抑制miR-133a的表达水平，也验证了这一点。主要作用机制是lncRNAs ABHD11-AS1通过调控miR-133a，进而上调其下游靶基因EGFR的表达，从而促进卵巢癌的恶性表型。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突