张浩 方新梅 张玛丽

糖尿病性视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病性微血管病变中具有特异性改变的眼底病变，是糖尿病严重的并发症之一[1]。由于该病是一种阶段性疾病，一般确诊即为晚期，因此及时诊断和治疗对于挽回患者视力损失至关重要。miRNA是一类高度保守的非编码小分子RNA，它几乎参与机体内所有生理和病理过程，可作为新型诊断标志物和治疗靶点[2]。有研究发现miRNA可参与糖尿病及其并发症的发生，多种miRNA的差异表达与DR的发生存在密切联系[3]，其中miR-3197和miR-2116-5p可作为DR有效的生物学标志物或治疗靶点，但是目前该方面的研究内容较少且结论尚未统一。对此，本研究对循环miR-3197、miR-2116-5p在DR患者中的表达进行分析，探究miR-3197、miR-2116-5p的差异表达与DR的相关性，确定二者对于DR的诊断价值。

资料与方法

1病例资料 选择2018年7月～2020年3月在我院确诊为DR的2型糖尿病（Type 2 diabetes，T2DM）患者72例作为研究对象，并收集同期未有DR的T2DM患者72例作为对照组。其中男性76例，女性68例，年龄在60～80岁之间，DR组平均年龄（65.32±4.56）岁，非DR组平均年龄（65.46±5.17）岁。纳入标准：①符合美国糖尿病协会的T2DM诊断标准[4]；②所纳入患者血糖控制在正常水平。排除标准：①患有急性或慢性炎症性疾病者；②青年期发病的糖尿病、线粒体糖尿病或1型糖尿病者；③伴有全身系统性疾病者。本研究所有患者均知情并签署知情同意书，获我院伦理委员会批准（批号：2017-QT-15）。

2诊断标准 T2DM[4]：①空腹血糖＞7.0 mmol/L；②餐后2小时血糖＞11.1 mmol/L；③HbA1c＞6.5%。DR：糖尿病患者的视网膜出现病变，如视网膜有出血点，有黄白色渗出或出血，或者有视网膜前增殖。DR分级标准依据美国早期治疗糖尿病性视网膜病变评分（early treatment diabetic retinopathy study，ETDRS）[5]：10～30分为1级；31～40分为2级；41～50分为3级；51～60分为4级；60～85分为5级。分级越高DR病情越严重。

3实验室指标 采集外周血标本5 mL，离心（3 000 r/min,15 min）分离患者血清，检测总胆固醇（total cholesterol,TC）、三酰甘油（triacylglycerol,TG）、糖化白蛋白（glycosylated albumin,GA）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol,LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol,HDL-C）、空腹血糖（fasting plasma glucose,FPG）、载脂蛋白A（apolipoprotein A,ApoA）、载脂蛋白B（apolipoprotein B,ApoB）、糖化血红蛋白（glycosylated hemoglobin,HbA1c）、血肌酐、白细胞计数（white blood cell count,WBC）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase,AST）、谷丙转氨酶（alanine aminotransferase,ALT）、血尿素氮（blood urea nitrogen,BUN）、血尿酸（uric acid,UA）、肌酐（creatinine,Cr）以及尿白蛋白/肌酐（UACR）。体重指数（BMI）计算为体重（kg）/身高（m）2。

4循环miRNA的提取纯化 通过使用Beckman J-6M感应驱动离心机（Beckman Instruments,California,USA）在4℃下以6 000 g双重离心15 min提取血清样品，随后将样品分装并于-80 ℃储存以备RNA提取。根据制造商的说明，使用miRNeasy Serum/Plasma Kit（Qiagen,Hilden,Germany）从血清样品中分离miRNA。使用Agilent 2100生物分析仪和RNA 6000 Nano/Pico LabChip（Agilent Technologies,Boeblingen,Germany）评估RNA的质量。

5microRNA分析研究 每个微阵列能够检测8 273种miRNA，对照探针用于评估质量，GenePix 4000B激光扫描仪（Molecular Devices,California,USA）和Array-Pro图像分析软件（Media Cybernetics）分别用于收集和数字化荧光图像。在本研究中，差异表达的miRNA使用Bioconductor EdgeR进行鉴定，该软件包用于分析由RNA测序技术产生的数字基因表达数据，主要测试差异表达，如果miRNA具有|log2（倍数变化）＞1|且P＜0.05，则认为存在差异表达，利用cluster软件得到差异表达基因的表达模式聚类。

6RT-qPCR 在逆转录为互补DNA之前，将3.5 μL来自秀丽隐杆线虫（cel-miR-39）的合成miR-39添加到提取的miRNA作为掺入对照（1.6×108copies/μL工作溶液）。使用miScripts Ⅱ RT Kit（Qiagen,Germany）逆转录总RNA。每个逆转录反应体系包含2 μL RNA模板、1 μL miScript Reverse Transcription Mix、4 μL 5×miScript RT缓冲液和13 μL无RNase水，最终体积为20 μL。使用iCycler系统（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）进行逆转录（37℃孵育1 h，95℃孵育5 min）。随后将cDNA稀释10倍，然后再添加到每个qPCR反应体系中。每个反应体系包括6.2 μL SYBR Green PCR Master Mix（BioRad,Hercules,CA,USA）、1.2 μL miScript通用引物、1.2 μL特异性引物、2 μL cDNA和1.9 μL无RNase水。根据制造商说明书设置反应条件：95℃15 min，94℃ 15 s、55℃30 s和70℃30 s重复40个循环。该反应在Mx3005P qPCR系统（Stratagene，美国）上进行。每个样品重复3次。熔解曲线和扩增图用于检查反应的特异性。循环miR-3197（Hs_miR-3197 miScript Primer Assay,MS00041874,Qiagen,Germany）和miR-2116-5p（Hs_miR-2116-5p miScript Primer Assay,MS00031598,Qiagen,Germany）的水平在标准化后通过2-ΔΔCt（循环阈值）方法进行定量分析。

7统计学处理 利用SPSS 23.0统计软件进行数据统计分析，计量资料均以平均数±标准差（）表示，组间比较采用t检验；计数资料使用百分数（%）表示，组间比较采用χ2检验。Shapiro-Wilk正态性检验用于检验变量是否呈正态分布。Spearman检验循环miR-3197和miR-2116-5p与DR的相关性，Pearson检验miR-3197和miR-2116-5p与GA、FPG、UACR以及HbA1c的相关性。计算ROC曲线下面积（area under curve，AUC）以评估候选 miRNA 的预测值。

结果

1两组患者基线资料对比 DR组患者的GA、FPG、UACR以及HbA1c指标高于非DR组，差异具有统计学意义（P＜0.05），两组患者在年龄、BMI、糖尿病病程、TC、Cr、HDL、LDL、TG 以及BUN方面没有显著的组间差异（P＞0.05），见表1。

表1 两组患者基线资料对比

续表1

2两组患者基因表达差异对比 通过μParaflo™MicroRNA微阵列检测到共有73种miRNA在DR病例中差异表达，其中，miR-3197和miR-2116-5p在DR患者中的含量显著高于非DR患者（miR-3197，|Log2（Fold Change）|=8.96，P＜0.001；miR-2116-5p，|Log2（Fold Change）|=8.38，P＜0.001），见表2。基于两组差异表达基因聚类分析结果，上调基因和下调基因分别聚为两大类，红色表示表达上调，绿色表示表达下调，差异倍数以log2Ratio表示，见图1。

图1 两组DR相关差异表达基因聚类分析图（A：非DR组；B：DR组）

表2 μParaflo™ MicroRNA微阵列分析检测到的循环miRNA的差异表达

续表2

3两组患者基因表达差异验证 通过RT-qPCR分析验证发现，与非DR组对比，DR病例中miR-3197和miR-2116-5p表达均显著上调（miR-3197：倍数变化=1.67，P=2×10-7；miR-2116-5p：倍数变化=1.33，P=6×10-5），见图 2。

图2 两组患者基因表达差异验证

4循环miR-3197和miR-2116-5p水平与DR及血液指标的相关性分析 采用Spearman法对循环miR-3197和miR-2116-5p水平与DR进行相关性分析，结果显示miR-3197和miR-2116-5p与DR均呈显著正相关（P均＜0.001），见图3。Pearson相关性分析结果显示，DR组患者血清miR-3197和miR-2116-5p水平与GA、FPG、UACR以及HbA1c均呈显著正相关（P＜0.05），与其他指标之间无明显相关性，见表3。

表3 循环miR-3197和miR-2116-5p水平与血液指标的相关性分析

图3 循环miR-3197和miR-2116-5p水平与DR的相关性

5循环miR-3197和miR-2116-5p对DR的诊断价值 miR-3197和miR-2116-5p的ROC曲线下面积（area under curve，AUC）分别为 0.903和0.875，表明这两种循环miRNA可以识别患有DR的风险，两种miRNA联合检测的AUC为0.976（95%CI：0.905～0.997），准确率为91%，优于单独检测，见表4，图4。

图4 联合预测因子及各原始协变量预测DR的ROC曲线性

表4 联合预测因子及各原始协变量对DR诊断的AUC及其他参数估计

讨论

DR是由于糖尿病患者血液成分改变而引起的血管内皮细胞功能异常导致的血视网膜屏障受损，是糖尿病的常见并发症之一，也是老年人视力丧失的主要原因[6-7]。在当今社会，DR已成为最突出的公共卫生威胁之一[8]。相关研究显示[9-10]，在全世界近2.85亿糖尿病患者中，超过三分之一的患者有并发DR的迹象，在我国9 240万成人糖尿病患者中，约43%的糖尿病患者已经患有视网膜病变，严重威胁患者的生命健康和生活质量[11]。此外，由于DR是一种多阶段的发育性疾病，其诊断往往发生在晚期，因此，迫切需要高敏感性和特异性的新型非侵入性或微创生物标志物用于DR的早期诊断。

作为高度保守的内源性非编码RNA，miRNA通过抑制mRNA翻译或通过与靶基因的3'-UTR结合抑制蛋白质翻译来调节基因表达，miRNA广泛参与细胞发育、组织分化、细胞增殖和凋亡等生理和病理过程[12]，并在DR的发病机制中发挥重要作用。研究发现[13]，链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病大鼠视网膜中的miRNA发生异常表达，可通过影响糖尿病大鼠的关键调节功能参与DR发生的早期阶段。一项miRNA分析研究表明，在STZ诱导的糖尿病大鼠的视网膜和视网膜内皮细胞中，存在多种miRNA上调的情况[14]。2019年，JI等人[15]的研究成果表明DR病例中多种miRNA存在差异表达，其中miR-2116-5p和miR-3197显著上调。在本研究中，我们通过μParaflo™MicroRNA微阵列检测到73种miRNA在DR病例中差异表达，其中，miR-3197和miR-2116-5p在DR患者中的含量显著高于非DR患者，并通过RT-qPCR技术验证，这些结果与既往研究相符。另有研究发现[16]，在DR患者的视网膜中有80种miRNA发生上调，6种miRNA发生下调，且部分miRNA表达的改变与DR之间存在显著相关性。对此，本研究通过Spearman法对循环miR-3197和miR-2116-5p与DR进行相关性分析，结果显示循环miR-3197和miR-2116-5p水平与DR均呈显著正相关，这进一步说明了miR-3197和miR-2116-5p可参与DR的发生。

DR的发生受多方面因素影响，本研究通过对比DR患者与非DR患者的一般资料，确定GA、FPG、UACR以及HbA1c指标是DR的影响因素。黄国强[17]等的研究表明，DR患者的FPG和HbA1c水平明显高于非DR患者，是糖尿病患者发生DR的独立危险因素。张危[18]等的研究显示，UACR与T2DM患者DR的发生和发展密切相关，可作为重要的预测指标。孙东海[19]的研究表明，GA水平与血糖水平、糖尿病病程、TC等多种因素密切相关，与T2DM患者DR的发生具有一定关系。本研究通过对比DR患者与非DR患者的一般资料，确定GA、FPG、UACR以及HbA1c指标是DR的影响因素，这与既往研究相符。此外，为了进一步确定miR-3197和miR-2116-5p与DR的关系，我们采用Pearson法对miR-3197和miR-2116-5p与GA、FPG、UACR以及HbA1c的相关性进行分析，结果显示miR-2116-5p及miR-3197分别与 GA、FPG、UACR以及HbA1c之间呈正相关，提示这两种miRNA可能与DR发生发展及其微血管病变密切相关。因此，miR-2116-5p及miR-3197水平显著上调可能是DR发生的早期风险预警，应尽早采取相应措施对病情进行有效控制。通过ROC曲线评估循环miR-3197和miR-2116-5p对DR的诊断敏感性和特异性，结果显示miR-3197和miR-2116-5p的AUC分别为0.903和0.875，与JI等[15]的研究中miR-3197和miR-2116-5p诊断DR的AUC相符，表明这两种循环 miRNA可以识别DR的发生风险。本研究中miR-3197和miR-2116-5p联合检测的AUC为0.976，显著大于单项检测，提示两种miRNA的组合检测对DR具有更高的诊断能力。

本研究通过微阵列分析DR组和非DR组多种差异表达的miRNA，但并未一一验证，这是本研究的局限性，其他显著上调的miRNA将在未来的研究中进行探讨。

综上所述，循环 miR-3197 和 miR-2116-5p在DR患者中显著上调，与DR病情严重程度及多种DR相关指标密切相关，可能参与病情发生发展过程，二者联合检测对于DR具有更高的诊断价值，在临床诊疗中具有一定的应用前景。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突