黄少隆，张翠惠，黄冬枚，郭文婷，郑庆茹，周 湧

广东省东莞市滨海湾中心医院检验科，广东东莞 523903

对自然界中的细菌而言，金黄色葡萄球菌(以下简称为金葡菌)是最普通最广泛的存在，其对生长环境要求较低，耐受性强[1]，并能产生多种毒素，其中血浆凝固酶、溶血素、肠毒素、毒性休克综合征毒素等对感染人群威胁巨大[2-3]。化脓、呕吐、腹泻、肠炎及休克是感染金葡菌的患者常出现的临床症状，更严重的是，当感染进一步发展成全身性败血症时，患者死亡的概率极高[4-5]。然而由于抗菌药物的滥用，金葡菌耐药性增加的趋势变得越发难以控制，近些年甚至出现对万古霉素敏感性下降的耐甲氧西林金葡菌(MRSA)菌株[6-7]。采用传统抗菌药物治疗已经面临严峻挑战，这迫使研究人员必须积极寻求新型抗菌药物。毒力因子就像金葡菌的武器，决定着其杀伤力的大小[8]，因此如何夺取和削弱“武器”是当前研究的热点。

山豆根，在中国有着悠久的运用历史，来自越南槐的干燥根及根茎[9]，据记载这味中药材性寒、味苦，可用于清热、消肿、抗菌等[10]。作为一味中药材却含有多种生物碱，多糖及有机酸，药用价值较高，但与此同时也有一定的毒性效应，这吸引着人们不断对其进行探索和研究[11]。近代研究更证实了山豆根醇提取物，在实验条件下具有抗病毒、抑菌、抗氧化的作用[12-13]。但是，山豆根是否对金葡菌毒力表达有影响，迄今为止，尚未见关报道。本实验拟测定山豆根对金葡菌的最低抑菌浓度(MIC)，细胞膜通透性、菌体形态变化、溶血活性和外毒素的影响，旨在为山豆根削弱毒力的机制研究及临床上山豆根在抗菌治疗中的应用提供参考。

1 资料与方法

1.1菌株来源 金葡菌菌株ATCC29213来自广东省临床检验中心。MRSA分离于临床患者标本。

1.2仪器与试剂 主要试剂包括β-半乳糖苷酶、脱纤维兔血(Solarbio公司)，α-溶血素多克隆抗体和溶葡萄球菌素、金黄色葡萄球菌A型肠毒素(SEA)和金黄色葡萄球菌B型肠毒素(SEB)多克隆抗体、氮酪蛋白(Sigma公司)，HRP标记的羊抗兔(Solarbio公司)。主要仪器包括Phenom G6 pure型扫描电镜、菲勒D-7型分光光度计、EPS 600型电泳仪(Tanon公司)、Microfuge5804R型台式冷冻离心机(Eppendorf公司)、iQ5型实时荧光定量PCR仪(Bio-Rad公司)、HM-96A型酶标仪(恒美科创公司)、Nano-600型超微量核酸分析仪(上海嘉鹏公司)、Tanon 5200型全自动化学发光图像分析系统(Tanon公司)。

1.3方法

1.3.1山豆根 用40目筛将粗粉过筛后取1.5 g于索氏提取器进行提取，为其湿润滴加2 mL无水乙醇-浓氨试液(3∶2)。放置0.5 h，再加80 mL三氯甲烷后进行4 h加热回流提取。提取液浓缩剩药渣后用甲醇溶解，移至容量瓶，混匀过滤，得到1.5 g提纯药粉，用于后续实验。

1.3.2山豆根对金葡菌的MIC及金葡菌生长曲线测定[14]实验根据美国临床与实验室标准化协会(CLSI)推荐的标准方法来测定山豆根对金葡菌的MIC。使用紫外分光光度计调定菌液浓度为A600=0.4。用MH培养基将该菌液再次稀释100倍，使得待测菌液的浓度达到5×106CFU/mL。量取上述提取1.5 g的山豆根药粉装入1.5 mL离心管中，将1.5 g/mL溶液稀释至0.96 g/mL，后续再二倍稀释依次为0.960 0、0.480 0、0.240 0、0.120 0、0.060 0、0.030 0、0.015 0、0.007 5 g/mL。配制完毕，每实验孔不同梯度浓度的100 μL山豆根加上100 μL菌悬液溶液，肉眼观察结果。生长曲线测定，调定菌液浓度A600=0.4，加入不同山豆根的量使得30 mL的溶液最终浓度调整为0、0.015、0.030、0.060 g/mL。12 h内每过1 h检测A600并记录。整个实验过程锥形瓶均在摇床中继续培养。

1.3.3金葡菌内膜滲性实验[14]调整菌液使A600=0.4，加入不同山豆根的量使得30 mL的溶液最终浓度调整为0、0.015、0.030、0.060 g/mL。0～8 h内每隔2 h从摇床上的不同培养液中各取出20 mL，离心，去沉淀，往上清液中加入邻硝基苯-β-D-半乳糖苷(ONPG)进行反应，其浓度为0.05 mol/L。底物反应于水浴箱中进行，反应环境为37 ℃，40 min。加入8 mL浓度为0.5 mol/L Na2CO3终止反应，充分溶解，检测A420(反映β-半乳糖苷酶的活性，β-半乳糖苷酶的活性越高，金葡菌内膜滲性就越高，表明细胞膜完整性受到破坏)。

1.3.4扫描电镜实验实验[14]按照要求制备玻片。调整菌液使A600=0.4，将菌液加入24孔板中37 ℃培养过夜。次日，将0.03 g/mL山豆根加入到菌悬液中作用0、1.5、3.0 h。磷酸盐缓冲液(PBS)缓慢地冲洗24孔板底部3次，每次15 min，戊二醛进行固定2 h。冲洗后再用锇酸固定30 min，使用50%，70%，80%、90%、100%的乙醇冲洗。最后使用叔丁醇置换乙醇，真空干燥，离子喷金，进行扫描电镜观察。

1.3.5山豆根对金葡菌的溶血能力的影响 按上述方法配制山豆根浓度为0 g/mL(作对照)及0.015、0.030、0.060 g/mL，并与阴性对照(未加入金葡菌)进行比对。金葡菌菌液离心弃沉淀，取100 μL上清液，800 μL缓冲液，25 μL脱纤维兔血混匀。放置37 ℃温箱30 min后离心，检测A543。

1.3.6测定山豆根作用后金葡菌外毒素的表达 调整菌液使A600=0.3，加入不同山豆根的量使得30 mL的溶液最终浓度为0、0.015、0.030、0.060 g/mL。当加有药液的菌液A600=2.5时，每个梯度取2 mL菌悬液进行离心，分离上清液，沉淀蛋白。次日重复一次，保留沉淀，用冰乙醇进行反复洗涤3次风干。最后加入1 μL苯甲基磺酰氟(PMSF)和10 μL 0.1 mol/L的Tris缓冲液将沉淀溶解后进行Western blot检测。

2 结 果

2.1山豆根的MIC及其对金葡菌生长的影响 对于金葡菌标准株ATCC29213，山豆根的MIC为0.06 g/mL。对于MRSA菌株观察得到抑菌作用略差，MIC为0.12 g/mL。不同浓度山豆根作用下金葡菌的生长曲线见表1、图1，在同一时间点上山豆根浓度越高，对生长的抑制越明显。

表1 不同浓度山豆根作用下金葡菌菌液A600的检测值

续表1 不同浓度山豆根作用下金葡菌菌液A600的检测值

图1 不同浓度山豆根作用下金葡菌的生长曲线

2.2山豆根作用不同时间点的金葡菌内膜通透性的变化 随着山豆根浓度的升高，β-半乳糖苷酶的活性也逐渐增加，见表2、图2。

图2 山豆根作用后金葡菌β-半乳糖苷酶的活力变化

表2 不同浓度山豆根作用下MRSA菌株菌液在A420的检测值

2.3扫描电镜下细菌的形态分析 在0.03 g/mL山豆根刺激作用下，0、1.5、3.0 h不同时间点，细胞形态发生着显著的改变。对照组中，菌体形态正常呈现圆形均匀，细胞膜完整，表面平滑没有粘连。山豆根作用1.5或3.0 h时细胞均有不同程度的变化，菌体形态不再是完整的球状，1.5 h时的细菌已破裂，发生扭曲，凹陷，但有少数菌体仍处于完整的状态。3.0 h时，菌体破裂程度进一步加深，周围出现碎片，菌体数量减。见图3。

注：A为对照组；B为山豆根作用1.5 h时；C为山豆根作用3.0 h时。

2.4山豆根对金葡菌溶血活力的影响 在0、0.015、0.030、0.060 g/mL浓度的山豆根作用下，金葡菌溶血能力呈逐渐下降趋势，溶液颜色逐渐由红色变成无色，溶血活力分别为100.00%、67.80%、37.13%、9.11%、9.01%,见图4。

注：A为溶液颜色观察；B为菌株溶血活力随山豆根作用浓度的变化情况；**表示与未标记组比较P<0.05。

2.5Western blot检测山豆根对毒力蛋白的影响 随着山豆根浓度增加，蛋白条带宽度变窄，说明山豆根对金葡菌这3种毒素表达量的影响随作用浓度的增加而增加。山豆根作用浓度为0.060 g/mL时，SEA和SEB的条带颜色几乎看不见，即此浓度下可以完全抑制SEA和SEB的分泌。因此，MIC的山豆根对金葡菌所分泌的有着显著的抑制作用，且作用效果有剂量依赖性。见图5。

图5 亚抑菌浓度的山豆根对MRSA菌株分泌的α-溶血素、SEA以及SEB蛋白的western blot分析

3 讨 论

控制细菌感染的治疗中，抗菌药物的使用无疑是人类手中的杀手锏，然而细菌耐药性的发展正是为躲避“追杀”而演化出的特殊技能，人类对此无能为力。研究表明，金葡菌可以通过群体感应系统来感知外部感染环境及菌群的密度的变化，从而调节菌群的速度及多种毒力因子包括α-溶血素、SEA以及SEB等的表达[15]，使菌群群体行为更有利于生存。如果控制细菌毒力的表达同时又不对细菌生存产生选择性的压力，这可能是阻止细菌耐药发展进程的最佳手段。同时，当细菌失去了毒力因子后，攻击力大幅度下降，此时机体的免疫系统则可以发挥更全面更有效的清除作用[16]。因此，许多研究者把目光转向天然的中草药抑菌研究中，以期从中分离出此类抗菌抑制物。研究表明，山豆根中含有黄酮类、生物碱类、酚类、皂苷类、有机酸、多糖、微量元素等多种化学成分[17]，清热解毒的特性可用于临床上咽喉肿痛、牙龈发炎、肝炎、黄疸等病症。近年来，其在抗菌及抗病毒方面的作用的研究也备受关注。苦参碱类为山豆根根状茎中主要的活性成分之一，研究表明其对H3N2流感病毒及柯萨奇B3病毒有着明显的抑制作用[18]，而乙型肝炎病毒则对喹诺里西啶类生物碱敏感[19]。山豆根中含有的众多种生物碱对多种细菌也具有抑制作用，呈现量效关系[20]。但山豆根对金葡菌抑制作用研究甚少，基于此本实验从金葡菌的生长、细胞膜完整性、溶血能力及外毒素的表达等方面进行研究，现分析如下。

山豆根对金葡菌的生长抑制作用较差，对于金葡菌标准株ATCC29213，山豆根的MIC为0.060 g/mL。同时对比发现，其对于MRSA菌株抑制作用更弱，MIC为0.120 g/mL，提高了1倍。随着作用时间增加，每个浓度梯度的金葡菌均有所增殖，但速率却不尽相同。无山豆根组曲线反映的是在正常不受任何外界环境的刺激下的生长情况，金葡菌在各个时间点的菌液吸光度始终呈现上升趋势。在0.015 g/mL山豆根作用后，生长曲线略低于正常生长曲线，在0.030 g/mL山豆根的作用下，金葡菌的增殖更加缓慢；在0.60 g/mL山豆根作用下，9 h后金葡菌的生长曲线明显受到抑制。

金葡菌正常的生长状态下，β-半乳糖苷酶存在于细胞膜内，并不会分泌到外界。但如果当细胞膜完整性受到破坏，β-半乳糖苷酶便会通过膜渗透到悬液中，使A值发生改变。所以，可通过检测β-半乳糖苷酶的活力来研究山豆根对金葡菌细胞内膜的破坏程度。实验表明，山豆根可破坏金葡菌细胞膜通透性，增加山豆根的浓度，可升高溶液的A420值，两者存在正相关性，这表明山豆根对金葡菌细胞膜通透性破坏能力呈剂量依赖性。随着山豆根浓度的升高，β-半乳糖苷酶的活性也逐渐增加。山豆根破坏了细胞膜的完整性，浓度越高破坏力越强，细胞膜的内膜通透性增大，β-半乳糖苷酶从胞内流入胞外。在本次研究中，当山豆根浓度为0.060 g/mL时，其能够持续作用于金葡菌细胞膜，而0.015 g/mL和0.030 g/mL的时间线均呈现出抛物线，分别在2 h和4 h达到高峰。这表明，山豆根浓度为0.060 g/mL时对金葡菌感染治疗有较理想的药用价值。为了更直观地证明山豆根主要作用于金葡菌细胞膜结构，本实验利用扫描电镜从形态上判断菌体细胞是否受到山豆根的损害。从图中可以看出，在山豆根作用下的金葡菌细胞膜结构均受到不同程度的破坏，特别是作用3 h后可以明显观察到菌体周围出现碎片，细菌数量减少等现象。根据以往研究报导，可以推断出在山豆根作用下，它可以首先作用于蛋白质，脂质等细胞外膜，随着时间的增加，它可以穿过肽聚糖进入细胞膜，使得细胞膜发生显著的弯曲和畸形。

金葡菌的溶血素有着很强大的溶血能力，对人类细胞破结构坏力巨大，并在细胞膜表面形成多聚体通道，造成细胞内信号肽、蛋白质、无机盐、酶等生物分子流失。溶血素还可以引起血管抽搐，造成血流不畅，导致组织缺血坏死。如果大量的溶血素进入大脑血管，可以使人脑生物电骤停，使生命体死亡。本实验主要通过测定不同浓度下的山豆根对金葡菌溶血活力的抑制作用，分别从定性以及定量两个方面来加以说明。实验可以直观地反映出有山豆根作用的金葡菌的溶血能力比无山豆根组弱，当浓度足够大时，溶液颜色达到最浅接近空白组。从定量的实验分析，在0.015、0.030、0.060 g/mL的山豆根作用下，金葡萄溶血能力分别为67.80%、37.13%、9.11%，逐渐下降到与空白组的9.01%相近。由以上可以得出结论，亚抑菌浓度下的随着山豆根作用浓度增加金葡菌的溶血能力下降。

Western blot从蛋白质水平分析了在0、0.015、0.030、0.060 g/mL的山豆根对3种金葡菌毒力蛋白α-溶血素、SEA和SEB的抑制情况。实验发现：相较于无山豆根组，加了山豆根的实验组随着山豆根浓度增大，条带宽度也越来越窄，表明这3种毒力蛋白表达减少。在0.06 g/mL的山豆根作用下，抑制的作用最明显。由此得出，亚抑菌浓度下的山豆根对金葡菌所分泌的α-溶血素、SEA和SEB有着明显的抑制作用，且作用效果呈剂量依赖性。

综上所述，提纯后山豆根粉对金葡菌的生长抑制作用不明显，对于MRSA菌株更是提高了一倍。但在在亚抑菌浓度下可使菌体胞膜的完整性被破坏使菌体形态发生改变，同时溶血活性下降，α-溶血素、SEA和SEB表达减少。鉴于各种毒素因子在金葡菌致病过程中的关键作用，山豆根具有成为抗金葡菌感染药物的潜力。