马慧可 李 萍 陈 佳 刘 欣 姚文涛 林 燕 何秀娟

糖尿病足溃疡(diabetic foot ulcer, DFU)创面迁延难愈，致残率、致死率高，给社会经济带来沉重负担[1, 2]。糖尿病足溃疡分为3型，即神经型、缺血型和神经-缺血型。随着糖尿病的发展，最终导致全身微循环障碍而致使并发症发生，包括糖尿病酮症酸中毒、糖尿病肾病、糖尿病性心血管病、糖尿病视网膜病变、糖尿病周围神经病变、糖尿病足等[3]。25%的糖尿病患者会发生糖尿病足溃疡，而糖尿病足溃疡会显著增加截肢风险和病死率，其中神经型患者的5年病死率高于霍奇金淋巴瘤、乳腺癌和前列腺癌，神经-缺血型患者的5年病死率高于大肠癌[4]。2007～2017年全国范围内1型糖尿病的发生率虽然仍处于较低水平，但呈现上升趋势。2021年，我国1型糖尿病新发人数中0～19岁为0.61万人。然而，1型糖尿病在中国的认知度和关注度仍然较低，其发生率被低估，相关研究较少，因此探索1型糖尿病及其并发症具有重要意义[5, 6]。

中性粒细胞是血液循环中首先迁移到炎症部位的免疫细胞，通过吞噬、脱颗粒作用，在细胞因子的产生、中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps, NETs)的释放、病原体的捕获和消除等固有免疫方面、适应性免疫方面以及防御功能方面发挥着重要的作用[7]。中性粒细胞被激活后，可形成镶嵌着组蛋白、中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase, NE)、髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)、组织蛋白酶G等杀菌蛋白的DNA网状结构NETs。研究发现，糖尿病足溃疡患者创面有大量NETs存在，而过多或持续存在的NETs可导致糖尿病创面愈合迟缓[8, 9]。糖尿病患者的血清中瓜氨酸化组蛋白H3(citrulline histone 3, Cit-H3)、游离的双链DNA和NE的表达均显著升高[8]。

佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)是体外刺激中性粒细胞产生NETs的经典诱导剂，其通过作用于蛋白激酶 C(PKC)，激活 Raf/MEK/ERK 信号通路及烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸氧化酶(NADPH oxidase，NOX2)，进而诱导 ROS 的产生，之后核心组蛋白H3/H4在肽酰基精氨酸脱亚胺酶4(peptidyl arginine deiminase 4, PAD4)的作用下发生瓜氨酸化，形成Cit-H3促使中性粒细胞核内染色体的解聚，随后胞核形态改变，核膜破裂生成NETs，并释放NE和MPO，这个过程被称为NETosis[10,11]。其中，Cit-H3是NETs最特异性的循环标志物[12]。

中性粒细胞是在骨髓中由造血干细胞分化而来的。虽然PMA诱导NETosis的机制已经比较清晰，但糖尿病动物模型中骨髓来源的中性粒细胞进行NETosis体外诱导的研究报道较少。因此本研究采用链脲佐菌素 (streptozocin，STZ)诱导1型糖尿病小鼠，通过动态观察不同浓度的PMA诱导糖尿病小鼠骨髓来源中性粒细胞NETs形成的影响，并分析NETs结构及组分，建立1型糖尿病小鼠体外NETs模型和检测方法，为研究糖尿病足溃疡NETs产生和调节机制奠定方法学基础。

材料与方法

1.实验材料:小鼠骨髓来源中性粒细胞分离试剂盒(货号：TBD2013NM)购自天津灏洋生物制品科技有限责任公司。高糖DMEM(5.5mmol/L,货号：11965092)、胎牛血清(货号：10100154)和核酸染料Sytox Green(货号：2204228)购自美国Thermo Fisher公司。PMA(货号：SLBX8889)购自美国Sigma公司。ROS探针DCFH-DA(货号：S0033S)和Alex Fluor®488(货号：A0423)标记山羊抗兔抗体购自中国上海碧云天生物技术研究所；兔抗鼠瓜氨酸化组蛋白H3(货号：ab5103)抗体购自英国Abcam公司；血糖仪及试纸(货号：479771)购自美国强生公司；链脲佐菌素(货号：S8050)、8mm细胞爬片(货号：YA0353)购自中国Solarbio公司；激光共聚焦(型号：蔡司LSM780)购自德国Zeiss公司；扫描电子显微镜(型号：S-3400)购自日本Hitachi日立公司。SPF级6～8周健康雄性 C57BL/6J小鼠20只，由斯贝福北京生物技术有限公司提供，体质量为22g左右; 室温22℃、湿度50%～60%、12h明暗交替，适应性饲养1周。动物生产许可证号：SCXK(京)2019-0010。

2.1型糖尿病小鼠模型制备：20只小鼠造模前禁食12h，避光环境中，腹腔注射由柠檬酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH4.5) 配置的 0.1% STZ(40mg/kg)，注射2h后进食，连续注射5天；注射结束1周后，隔天尾静脉采血检测随机血糖，血糖值>16.6mmol/L，则糖尿病小鼠模型造模成功[13]。

3.糖尿病小鼠骨髓来源中性粒细胞的分离：在无菌条件下，体外剥离糖尿病小鼠股骨和胫骨，匀浆冲洗液冲洗内腔中的骨髓，70μm细胞筛网过滤，450×g，离心10min，弃上清；红细胞沉降液重悬细胞；于离心管中依次加入3ml的中性粒细胞分离液与1.5ml的80%浓度中性粒细胞分离液；吸取1ml细胞悬液样本加于80%浓度中性粒细胞分离液液面上，750×g，离心30min。吸取下层白色环状中性粒细胞层，清洗，400×g，离心10min，弃上清，加入红细胞裂解液；细胞重悬于含10%胎牛血清的DMEM完全培养液，计数备用。

4.PMA体外诱导中性粒细胞NETs形成：用DMEM完全培养基重悬中性粒细胞，接种于激光共聚焦小皿中，在37℃、5% CO2培养箱中培养1h，分别加入PMA(0、100、200、400nmol/L)，培养2.5h后加入Sytox Green染料(0.4μmol/L)，激光共聚焦显微镜下动态观察3～7h。

5.荧光免疫组化法检测Cit-H3：中性粒细胞接种于激光共聚焦小皿中，PMA刺激6h后，加入4%多聚甲醛，室温固定20min；PBS洗；用含0.5% Triton X-100的PBS透化1min；PBS洗；滴加5% FBS的封闭缓冲液，37℃孵育1min；加入兔源抗-H3Cit抗体(1∶250)，4℃孵育过夜；PBS洗；加入羊抗兔Alex Fluor®488(1∶600)，37℃孵育1h；PBS洗，加入DAPI(1∶2000)避光染色5～10min，激光共聚焦显微镜观察。

6.细胞活性氧(ROS)检测：荧光分光光度计法：中性粒细胞接种于6孔板(2×106/ml)，5%CO2、37℃培养1h；加入PMA(100nmol/L)培养6h；800r/min，离心5min，弃上清；阳性对照组加入1ml ROSUP(50mg/ml)培养30min，800r/min，离心5min，弃上清；细胞收集后，重悬于1ml的DCFH-DA探针(1∶1000)中培养20min；洗涤，重悬细胞并接种于96孔板中，采用分光光度计法使用荧光酶标仪检测485nm/530nm荧光值。荧光免疫组化法：中性粒细胞接种于激光共聚焦小皿中，PMA刺激6h后，加入DCFH-DA探针(1∶1000)，孵育30min； 4%多聚甲醛固定；PBS洗，加入DAPI(1∶2000)避光染色5～10min，激光共聚焦显微镜观察。

7.扫描电子显微镜(SEM)下观察NETs形成：将加入PMA的小鼠骨髓来源中性粒细胞(2×106/ml)接种于TC处理的细胞爬片上，5%CO2、37℃培养6h，4.0%戊二醛固定。吸除培养液，PBS洗，2.5%戊二醛(pH 7.2～7.4) 4℃固定，PBS洗， 1%锇酸固定1h， PBS 洗，梯度乙醇脱水(30%、50%、70%、80%、90%、100%，5分钟/次)，CO2临界点干燥，真空喷镀，扫描电子显微镜下观察。

8.统计学方法：所有结果均来自于3次以上重复实验，应用 SPSS 20.0统计学软件对数据进行统计分析，GraphPad Prism 6.0软件作图，结果采用配对t检验或单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.中性粒细胞的分离纯度鉴定：中性粒细胞分离后涂布于载玻片上，待干片后进行快速吉姆萨染色，显微镜下观察并拍照。光学显微镜下见大量中性粒细胞，中性粒细胞呈现马蹄形或分叶状的细胞核，核的颜色为蓝紫色，可见淡紫色的中性粒细胞质，计数不同视野中中性粒细胞数量，统计分析其纯度达到85%以上(图1)。

图1 小鼠骨髓来源的中性粒细胞快速吉姆萨染色(×40)

2.PMA诱导糖尿病小鼠中性粒细胞形成DNA网状结构：通过激光共聚焦显微镜检测NETs形成：PMA处理后(100、200、400nmol/L)5h时可见绿色丝状或团状结构；6h时网状结构明显增多；刺激7h时，各组荧光开始减弱。与0nmol/L PMA比较，100nmol/L PMA刺激中性粒细胞6h时，网状结构生成显著增多，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01,图2)。

图2 PMA诱导中性粒细胞胞外DNA含量变化A.动态观察(荧光免疫组化法染色，×400)；B.Sytox Green 染色后用ImageJ软件定量分析6h时NETs*P<0.05，**P<0.01，n=3

3.PMA增强NETs结构组分Cit-H3水平：与200nmol/L、400nmol/L PMA比较，100nmol/L PMA刺激中性粒细胞6h时，网状结构生成显著增多，因此后续实验选用100nmol/L作为PMA诱导NETs的适宜浓度，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01,图2)。100nmol/L PMA绿色荧光明显增多(图3A)，提示PMA刺激中性粒细胞，显著上调了Cit-H3表达水平，差异有统计学意义(P<0.05,图3B)。

图3 PMA诱导中性粒细胞6h时Cit-H3(绿色)表达A.免疫荧光法：Cit-H3为绿色，胞核为蓝色(荧光免疫组化法染色，×400)；B.ImageJ软件定量分析Cit-H3(n=3)

4.PMA诱导中性粒细胞活性氧(ROS)升高：100nmol/L PMA糖尿病小鼠骨髓中性粒细胞ROS生成显著升高，差异有统计学意义(P<0.05，图4)。

图4 PMA诱导中性粒细胞6h时ROS生成A.免疫荧光法：ROS为绿色，胞核为蓝色(荧光免疫组化法染色，×630)；B.ImageJ软件定量分析ROS；C.荧光分光光度计法(n=3)

5.扫描电镜观察PMA诱导中性粒细胞出现NETs网状结构：0nmol/L PMA中性粒细胞表现出完整的正常细胞形态，无明显网状结构；而PMA处理组中性粒细胞变得扁平，形成膜突起或包膜破裂，从而形成粗细不一的纤维束状的网状结构(图5)。

图5 各组扫描电镜下NETs结构(×4000)A.0nmol/L PMA;B.100nmol/L PMA

讨 论

周围神经病变、周围动脉疾病、足部畸形、创伤与感染等是导致糖尿病足溃疡的关键因素[14]。糖尿病足溃疡的传统治疗方法如清创、抗感染与血运重建临床效果有限，而临床上新型治疗方法如物理疗法(激光、局部负压吸引、高压氧疗、药物离子导入等)、生物治疗(富集血小板和血小板衍生的生长因子疗法)、新型敷料(高分子合成敷料和人造生物敷料)、人皮肤移植、组织工程皮肤、干细胞疗法等取得了一定的临床疗效，但存在纤维化、不稳定性、免疫排斥、感染性、致癌性等安全性问题，整体费用高，易复发，给患者带来沉重的经济负担与精神压力[15]。研究发现，DPI(NOX2的强效抑制剂)、PAD4 抑制剂、脱氧核糖核酸酶Ⅰ (deoxyribonuclease Ⅰ，DNase Ⅰ)等NETs抑制剂处理可以有效阻止糖尿病患者和小鼠的中性粒细胞生成NETs[16, 17]。敲除PAD4的糖尿病小鼠创面NETs生成减少，创面愈合加快[8,18]。此外，硫化氢可通过抑制ROS介导的MAPK/ERK1/2和p38的激活来抑制NETosis形成，从而促进糖尿病伤口愈合[19]。提示抑制NETs生成可以显著改善糖尿病患者或糖尿病小鼠的创面愈合，为以NETs为靶点的糖尿病足溃疡治疗提供新的思路[11]。而糖尿病动物模型中性粒细胞的NETosis诱导可提供方法学基础。

目前常用的糖尿病小鼠模型有STZ诱导的1型、2型糖尿病小鼠(大鼠)或db/db小鼠。STZ对一定种属动物的胰岛β细胞有选择性破坏作用，能诱发动物发生糖尿病。1型糖尿病与2型糖尿病动物模型的制备与STZ注射的剂量有关系，大剂量注射时，由于直接引起胰岛β细胞的广泛破坏，可造成1型糖尿病模型。因此，STZ可建立一种简单、经济、稳定可靠同时病理表现与人类糖尿病类似的动物模型[20,21]。db/db小鼠是4号染色体的瘦素(leptin)受体基因缺陷导致的糖尿病小鼠。由于db/db小鼠不存在人为诱导因素的干扰，糖尿病的产生与临床患者更为相似，目前被认为是较理想的2型糖尿病研究用动物模型，但是价格昂贵[22,23]。STZ诱导的糖尿病小鼠和db/db小鼠创面Cit-H3表达升高，创面愈合延迟[8]。db/db小鼠创面造模后第15天，PAD4、NE、Cit-H3、MPO表达和游离DNA含量显著升高[19]。糖尿病小鼠很好地体现了糖尿病患者在NETosis易感性方面的病理特征，可用于NETs相关实验的研究。然而，糖尿病动物模型体内NETs诱导研究较普遍，但混杂因素众多，并不能明确NETs及其各组分的升高受某种具体因素(血糖、感染、细胞间相互作用等)的影响。因此，体外NETs的诱导研究尤为重要，本研究选用STZ诱导的1型糖尿病小鼠骨髓来源的中性粒细胞来建立体外NETs模型。

分离纯化中性粒细胞最常见的方法有免疫磁珠法和密度梯度离心法。免疫磁珠法分离细胞纯度高，操作简便、高效，国外应用较广泛且深受肯定，虽然价格昂贵，可作为常规分离纯化中性粒细胞的首选方法。用于NETs研究所分离的中性粒细胞要选用非活化磁珠分选试剂，以免操作过程中中性粒细胞被活化生成NETs。因此，本实验采用密度梯度离心法分离纯化中性粒细胞，该方法操作简便，成本低，细胞分离时间短，对细胞无明显毒性和刺激性，吉姆萨(Giemsa)染色后显微镜下观察分析中性粒细胞纯度可达90%。

刺激中性粒细胞释放NETs 的刺激因素包括多种病原体，如PMA、脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)和钙离子载体(A23187)等[24, 25]。对于STZ诱导的糖尿病小鼠和db/db小鼠的外周血中性粒细胞，LPS(25g/ml)刺激2.5h，Cit-H3表达、PAD4活性和NETs含量升高[8]。对于STZ诱导的糖尿病SD大鼠腹腔中性粒细胞，PMA(100nmol/L)刺激3～5h时NETs形成[26]。与PMA和钙离子载体A23187比较，LPS是一种更具生物学相关性的NETosis刺激物，但其诱导能力不稳定，需高浓度才具有良好诱导能力[25]。NETs的体外诱导物如LPS或IL-8等细胞因子存在价格昂贵、获取不易、诱导浓度高、时间长、效果不稳定等问题。因此，本研究选用NETs的经典诱导剂PMA，成功在较高诱导浓度(100nmol/L)与较长诱导时间(6h)下刺激1型糖尿病小鼠骨髓来源中性粒细胞产生显著性NETs。

本实验结果表明，PMA诱导1型糖尿病小鼠骨髓来源中性粒细胞NETs形成，100nmol/L PMA 6h时，NETs显著增多，并显著促进了Cit-H3表达与ROS释放。既往报道PMA(100nmol/L)刺激STZ诱导的糖尿病SD大鼠腹腔中性粒细胞3～5h时NETs形成，笔者使用PMA的刺激浓度和时间基本一致。显微镜下NETs结构与成分组成鉴定是评估NETs的重要标准，NETs具有独特的超微结构，其主要成分是直径为15～17nm的DNA纤维和直径为25～50nm的球形蛋白质结构域构成的可达50nm的三维网状结构[27]。本实验在激光共聚焦显微镜和扫描电镜下均可见PMA刺激后形成NETs网状结构。

综上所述，调控NETs生成是治疗糖尿病足溃疡的重要研究靶点，本研究建立了PMA诱导的1型糖尿病小鼠体外NETs模型，该模型中NETs的体外诱导与Raf-MEK-ERK信号通路的相关性需进一步验证。在糖尿病足溃疡复杂病理条件下，中医药在糖尿病足溃疡中NETs产生和调节机制的探索是笔者课题组后期体外研究的主要方向，这将为实现对NETs形成精细调控与新的治疗策略提供理论依据。