王 娟 茅 松

急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)是指肾功能快速下降的一组临床综合征，其与终末期肾脏疾病、心血管疾病、高血压等密切相关[1]。一项包括154项研究、350万例的大样本量Meta分析表明，AKI发生率高达21.6%，病死率为23.9%。重症监护患者的AKI发生率高达50%[2]。2013年我国大约有140万例符合改善全球肾脏病预后组织(kidney disease:improving global outcomes, KDIGO)诊断标准的 AKI 患者在各级医院接受治疗，他们的消费支出约130亿美元，给家庭、社会以及个人均造成了沉重的负担[3]。因此，早期识别、阻断、延缓AKI进展具有非常重要的意义。

传统观念认为，AKI与慢性肾病(chronic kidney disease，CKD)是两个相对独立的疾病，但随着研究的深入，有研究证实AKI 是CKD乃至终末期肾病(end stage of renal disease，ESRD)的关键性危险因素[4, 5]。肾脏的持续缺血、缺氧易导致肾脏慢性化的改变[6]。AKI有可能导致永久性的肾脏损害，进而增加发生慢性肾衰竭的风险。研究表明，与没有AKI病史患者比较，AKI后CKD风险增加8.8倍，ESRD升高约3.1倍[7]。研究报道提示，即使轻度AKI表现为明显的完全恢复，追踪调查3年仍发现有约1.5%的人群进展为CKD，后续随访发现，血清肌酐的适度增加与CKD发生风险增加90%相关联[8]。缺血再灌注(ischemia reperfusion, IR) 是导致AKI的最常见原因之一，肾移植术、局部肾切除术、输尿管阻塞等临床诊治过程中均不同程度的存在[9]。因此，寻找有效可靠的手段阻断IR-AKI的发生、发展对于AKI的早期防治及延缓向CKD进展显得尤为重要。

过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferators-activated receptor γ, PPAR-γ)是配体依赖型的转录因子，属于核受体家族。PPAR-γ与配体结合后，与视黄酸类受体(RxR)形成异二聚体，然后与调节基因启动子上游的过氧化物酶体增殖物反应元件结合而发挥转录调控作用[10]。它的生理作用包括调节各种代谢途径，例如脂质的生物合成和葡萄糖代谢[11]。噻唑烷二酮是一种通过激活PPAR-γ起作用的合成药物，罗格列酮 (rosiglitazone，RSG) 是其中的经典药物。业已证实，PPAR-γ激活对肾脏可能发挥保护作用，且可延缓CKD 的进展。因此RSG在AKI-CKD的转化中可能发挥阻断作用，笔者进一步研究观察RSG对急性肾IR模型的时间序列影响，试图从源头上观察其在AKI-CKD中肾脏纤维化、慢性化损伤、肾功能改变上的影响。

材料与方法

1.动物实验：所有实验均获得上海交通大学附属第六人民医院动物保护与使用委员会的批准[动物实验许可证号：SYXK(沪)2011-0128]。96只6～8周龄的雄性C57/B6小鼠,购自南京大学模式动物研究所，随机分为4组，即对照组(8只)、RSG组(8只)、IR组(40只,1、3、7、14、28天各8只)、IR+RSG组(40只，1、3、7、14、28天各8只)。其中对照组不作任何处理，与RSG组于RSG灌胃后28天取右肾评估；RSG组按10mg/kg隔天给予RSG灌胃至28天，后进行处理取材右侧肾脏以备评估；IR组通过夹闭小鼠右侧肾蒂1h，建立肾脏IR诱导的AKI模型，分别在第1天(IR1,n=8)、第3天(IR3,n=8)、第7天(IR7,n=8)、第14天(IR14,n=8)、第28天(IR28,n=8)进行处理取材右侧肾脏以备评估；IR+RSG组手术前30min按10mg/kg给予RSG灌胃，手术造模同IR组，之后隔天给予RSG，剂量为10mg/kg,分别在第1天(IR+RSG1,n=8)、第3天(IR+RSG3,n=8)、第7天(IR+RSG7,n=8)、第14天(IR+RSG14,n=8)、第28天(IR+RSG28,n=8)处理取材右侧肾脏以备评估。缺血再灌注1、3、7、14、28天分别命名为缺血再灌注1、3、7、14、28组。具体手术过程：术前按10ml/kg腹腔注射0.5%戊巴比妥，待麻药生效，将小鼠背部朝上固定于鼠板，右侧背部中部备皮，用眼科剪依次划开此处组织，用无齿镊分离出右侧肾脏，找到肾蒂，用动脉夹夹闭1h，依次缝合切口。

2.血液和尿液生物学标志物测定：通过直接心脏穿刺收集血液，并在约-80℃下制备冷冻的血清，直至进行批量分析。随后全自动生化分析仪检测血清中的尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)和肌酐。按实验计划于当天收取随机尿液，收集的尿液在约-80℃冻结，直到进行批次分析。用酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)法试剂盒(Mouse Albumin ELISA Kit, ab108792, 英国Abcam公司)检测尿微量白蛋白水平,用ELISA试剂盒(肌酐Cr试剂盒，C011-2-1,南京建成生物工程研究所)肌氨酸转化酶法检测血清尿素氮水平。

3.组织学检查：肾脏组织进行了苏木精-伊红(hematoxylin and eosin, HE)染色以观察肾脏损伤程度，行Masson染色观察组织纤维化程度。

4.肾脏组织基因表达分析：按实验计划处理取材右侧肾脏后，速冻于-80℃冰箱。使用Trizol试剂(trizol,15596-018,美国Invitrogen公司)从组织中纯化总RNA样品。使用DNA酶试剂盒(DNaseⅠ,K1622,RNase-free, 美国Thermo Scientific公司)去除总RNA样品中混合第DNA，使用cDNA反转录试剂盒(RevertAid First Strand Cdna Synthesis Kit,EN0521,美国Thermo Scientific公司)生成cDNA，并使用FastStartTM通用SYBR Green预混液(ROX)(FastStart Universal SYBR Green Master，4913850001，瑞士Roche公司)进行qRT-PCR，检测肾脏纤维化标志物(α-SMA、collagenⅠ、collagenⅢ)表达水平，使用delta deltaCT方法计算与空白组的相对基因表达。引物设计详见表1。

表1 引物序列(5′→3′)

5.Western blot法检测：用冰冷的PBS洗涤肾组织，并用常规方法在新添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂(PMSF)的冷RIPA缓冲液中裂解。通过SDS-PAGE凝胶测定组织蛋白水平，并用以下抗体印迹：抗β-actin[β-actin (13E5) Rabbit mAb，4970S，美国Cell Signaling Technology公司]、α-SMA(Rabbit anti-alpha smooth muscle actin antibody，bs-10196R，博奥森生物科技有限公司)、collagenⅠ(Rabbit anti-collagen Ⅰ antibody，bs-10423R，博奥森生物科技有限公司)、collagenⅢ(Rabbit anti-collagen Ⅲ antibody，bs-0948R，博奥森生物科技有限公司),使用ImageJ软件对蛋白质印迹结果进行定量。统计数据由GraphPad Prism 8.0(美国)绘制。

结 果

1.IR诱导了C57 / B6小鼠AKI向CKD的转化：动脉夹(小型)夹闭小鼠右侧肾动脉1h后去除，血BUN和血肌酐在术后第1天升高最为明显，后逐渐下降，第28天，IR组较对照组仍明显升高(P<0.05，图1、图2)。IR组尿微量白蛋白/尿肌酐术后第1天逐渐增加，在第7天达到峰值，后缓慢下降，在第28天IR组数值仍大于对照组 (P<0.05,图3)。组织病理学(HE)分析显示，IR组在第1天即出现肾小管损伤，后呈时间顺序性持续加重(图4)。Masson染色表明，胶原积累和沉积在第14天明显增加，后持续增加(图4)。RT-PCR分析显示，collagen Ⅰ于第1天明显升高，后持续增高 (P<0.05)，α-SMA与collagenⅢ于第7天明显升高，后持续增高 (P<0.05,图5)。Western blot法检测显示，IR组随时间发展纤维化因子(α-SMA、collagenⅠ、collagenⅢ)表达均增多(P<0.05，图6)。

图1 IR血尿素氮时间序列变化与对照组比较，*P<0.05

图2 IR血肌酐时间序列变化与对照组比较，*P<0.05

图3 IR尿蛋白/肌酐比值时间序列变化与对照组比较，*P<0.05

图4 IR肾组织病理时间序列改变(×40)

图5 IR纤维化因子mRNA时间序列改变与对照组比较，*P<0.05

图6 IR纤维化因子蛋白表达水平时间序列改变与对照组比较，*P<0.05

2.罗格列酮可延缓AKI-CKD转化：肾功能评估表明，对照组和RSG组肾功能没有差别；与对应IR分组(1、3、7、14、28天)比较，IR+RSG分组BUN在1、3、7、14天明显降低(P<0.05，图7)，血肌酐在7、28天明显降低(P<0.05，图8)。尿微量白蛋白/尿肌酐在术后3、14天明显减少(P<0.05,图9)。组织病理学(HE)分析显示，与对照组比较，RSG组无明显改变；与对应IR(1、3、7、14、28天)分组比较，IR+RSG (1、3、7、14、28天)分组肾小管损伤均减少(图10)。Masson染色表明，与对照组比较，RSG组无明显改变；与对应IR分组(1、3、7、14、28天)比较，IR+RSG分组(1、3、7、14、28天)纤维物沉积减少，且随时间延长，减少程度越来越明显(图10)。RT-PCR分析显示，与对照比较，RSG组未见明显差异；与IR组28天比较，IR+RSG组28天纤维化因子较IR组表达明显减少(P<0.05，图11)。Western blot法检测显示，与对照组比较，RSG组未见明显差异；与IR组28天比较，IR+RSG组28天纤维化因子(α-SMA、collagenⅠ、collagenⅢ)均显著减少(P<0.05)，详见图12。

图7 RSG干预对IR血尿素氮的时间序列影响与对照组比较，*P<0.05;与同组RSG-比较，#P<0.05

图8 RSG干预对IR血肌酐的时间序列影响与对照组比较，*P<0.05;与同组RSG-比较，#P<0.05

图9 RSG干预对IR尿蛋白/肌酐比值的时间序列影响与对照组比较，*P<0.05;与同组RSG-比较，#P<0.05

图10 RSG干预对肾组织病理时间序列改变(×40)

图11 28天时RSG干预对IR纤维化因子mRNA的影响与对照组和RSG组比较，*P<0.05;与IR组比较，#P<0.05

图12 28天时RSG干预对IR纤维化因子蛋白表达水平的影响与对照组和RSG组比较，*P<0.05;与IR组比较，#P<0.05

讨 论

AKI是一种发生率高、合并症多的疾病，持续进展可能诱导CKD，导致肾功能的持续恶化，诱发多系统的功能影响。因此，早期有效阻断AKI，并延缓其进展具有重要意义。IR是导致AKI的重要原因之一，动脉夹夹闭肾蒂一段时间后去除动脉夹是导致IR肾损伤的经典模型。笔者通过肾蒂夹闭1h后再松开模拟AKI，并试图分析研究RSG对AKI-CKD转化的作用。已有研究证实，双侧肾蒂夹闭40min或更长时间的缺血能够导致10天后小鼠无法存活[12]。虽然双侧IR模型更加贴近AKI慢性化发展病程，但是双侧模型往往不是特别稳定，而单侧模型往往损伤小，动物的死亡率低，且同样也能诱导肾脏慢性化的损伤发生[13]。本研究为更加有效地模拟IR所致的AKI-CKD的转化进展，遂行单侧夹闭肾蒂1天。笔者以AKI发生、发展的时间为线索，分别于1、3、7、14、28天观察其具体变化，形成AKI进展至CKD的时间序列变化。肾脏功能指标均于术后呈现上升趋势，后逐渐下降，7天后下降缓慢，但仍显著大于基础值(P<0.05)；HE染色所示的肾小管损伤呈现随时间加重趋势，Masson染色所示的纤维物沉积呈现进行性加重趋势，纤维化指标(α-SMA、collagenⅠ、collagenⅢ)改变趋势在RT-PCR 和Western blot法检测结果与之前一致。本研究中，IR导致的AKI没有完全修复损伤，其表现为肾功能持续恶化以及纤维化损伤持续加重，最终转化为CKD。

各种研究表明IR可能诱导AKI向CKD的转化，但并不是所有的IR所诱导的AKI都可转化为CKD，准确地说是在一定观察期内不会发生转化，但将观察期延长至生命终点，一次特定的AKI是否一定导致CKD值得商榷。一项综述分析表明，在一定观察期内，轻、中、重度AKI转化为CKD的概率逐渐上升[5]。大量研究表明，肾脏修复的能力与初始损伤的严重程度、频率和持续时间呈负相关[14]。当然，医疗水平、年龄和性别在转化过程中也发挥一定作用，但长远来看，损伤的严重程度是最为重要的影响因子。所以，笔者认为，AKI向CKD的转化是一个综合损伤累计的效应，当达到一定损伤阈值，累计损伤大于该阈值即可触发向CKD的进展。

RSG是一种PPARγ激动剂，临床上广泛应用于2型糖尿病，已被证明可通过改善抗炎、抗增殖和抗氧化应激的作用来保护肾脏，且对肾脏晚期肾病合并症有保护作用[15]。研究发现，在尿毒症环境中，高磷酸盐诱导的PPARγ失活是CKD血管内侧钙化发病机制中的重要事件，而PPARγ的激活可减轻CKD钙化[16]。研究发现，在单侧输尿管梗阻大鼠模型中，PPARγ激动剂治疗可通过降低肾脏中TGF-β、Ⅳ型胶原和纤连蛋白的表达来显着减轻肾间质纤维化[17]。同时在败血症所致的AKI的模型中，研究者发现缺乏PPARα(与PPARγ同为核受体家族) 的小鼠肾功能更差[18]。在本研究中，RSG预处理后，肾IR导致的肾脏功能损伤明显改善，纤维化损伤亦明显减轻，结果提示激活RSG预处理可能有效延缓AKI进展，减轻CKD肾纤维化损伤。

本研究以AKI后1、3、7、14、28天的时间序列为线索，观察AKI至CKD的动态演变。笔者发现1～3天是AKI的急性期，之后肾功能有所恢复，但纤维化损伤持续加重，肾脏损伤向慢性化发展，即AKI逐渐转化为CKD。RSG干预早期即发挥肾脏保护作用，第28天纤维化分子mRNA和蛋白表达水平较IR组均显著下降(P均<0.05)，这充分说明RSG早期干预可以有效的延缓IR诱导的AKI-CKD转化, 并且可以有效减轻肾脏纤维化损伤。

一项研究表明，AKI 不但可以诱发肾纤维化，并且还会对肺、心脏和肝脏产生有害的影响[19]。这与笔者发现的结果相吻合，持续性的AKI损伤刺激导致肾脏慢性化纤维化损伤，最终可能诱发一些列合并症。另有研究发现，RSG虽可降低肾小球滤过率，但长期并不会因此而损伤肾功能[20]。近年来研究表明，RSG的舒张血管的功能并不会直接导致心血管事件的发生，相反的还会不同程度的减少此类事件的发生[21]。本研究亦发现RSG早期持续干预可有效的改善肾脏损伤，减轻肾脏纤维化慢性损伤，这充分说明早期激活PPAR-γ可能是延缓阻断AKI-CKD转化的有效靶点。本研究进行至28天,如果延长研究时间可能更有助于进一步深入分析延缓AKI-CKD转化后一系列肾脏合并症的影响，以及对其远期并发症的影响。

综上所述，RSG可有效延缓AKI向CKD的转化，保护肾功能，减轻肾脏纤维化损伤。线粒体功能障碍、氧化应激、炎症刺激等多种因素可能参与了RSG对肾脏的保护机制，但是其具体机制仍有待于进一步研究。AKI-CKD的转化，AKI后对其他脏器的影响及PPARγ对AKI及其并发症的远期影响仍需开展进一步研究。