张莉（北京艾迪康医学检验实验室,北京 100176）

乙型病毒肝炎DNA（HBV-DNA）是一类嗜肝细胞DNA病毒，是感染人类最小的DNA病毒，具有易传染、难治愈的特点，其本身对肝脏没有致病性，只有在免疫细胞参与的情况下才会导致肝损伤[1]。我国是乙型病毒肝炎病毒感染人群最多的国家，乙型肝炎随着病情进展可逐渐发展为肝硬化、肝癌，我国每年约有30多万人因肝硬化、肝癌等肝脏疾病死亡[2]。因此，准确及时地诊断对乙肝患者的预后极其重要。临床上HBV-DNA检测主要依靠荧光定量PCR检测法，是一种能够准确获得病毒载量的定量检测方法。检测前常常需要提取样本的DNA，目前主要有手工煮沸法（手工法）和全自动磁珠法（全自动法）两种。本研究依据CNAS-CL02《医学实验室质量和能力认可准则》、CNAS-GL039《分子诊断检验程序性能验证指南》等相关要求对HBV-DNA检测的两种不同核酸提取方法在使用相同的仪器和试剂的条件下进行性能验证，分析其验证结果，从而选择合适的优化系统提高实验的正确性。

1 资料与方法

1.1标本来源 HBV-DNA阳性标本（北京艾迪康医学检验所有限公司）；正确度验证室间质评样本（国家卫生健康委临床检验中心）；精密度验证高低值室内质控品（北京康斯坦彻公司）。

1.2仪器和试剂 实时荧光定量PCR检测采用美国ABI7500实时荧光定量PCR仪；核酸提取仪为中山达安基因公司Smart32全自动核酸提取仪；检测试剂采用中山达安基因公司生产的HBV-DNA检测试剂盒；长沙湘智高速冷冻离心机。

1.3方法

1.3.1批内精密度 采用北京康斯坦彻公司生产的HBV-DNA质控血清，样本浓度为3.01×106Copies/ml作为高值血清样本和2.54×103Copies/ml作为低值血清样本，由同一操作人员在同一台仪器进行检测。采用手工法和全自动提取法在同一次实验中重复检测高低值血清样本各20次，记录结果并计算均值、标准差和变异系数CV（%）。

1.3.2批间精密度 采用北京康斯坦彻公司生产的HBV-DNA高值血清，样本浓度为2.11×106Copies/ml，每个工作日分别采用手工法和全自动提取法在同一次实验中各检测1次，检测时间为2021年12月1日-2021年12月31日，共计23个质控数据，记录结果，计算均值、标准差和变异系数CV（%）。

1.3.3正确度 采用国家卫生健康委临床检验中心的标准物质作为参考物质，进行正确度验证实验。选取5个浓度水平的参考物质，每种重复检测2次，连续检测5天，取平均值并计算每个浓度水平的偏倚。

1.3.4线性范围 取一份HBV-DNA混合血清定值为2.58×108Copies/ml的样本进行验证，用阴性血清标本按1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000、1∶100000、1∶1000000系列进行稀释至浓度为2.58×107Copies/ml、2.58×106Copies/ml、2.58×105Copies/ml、2.58×104Copies/ml、2.58×103Copies/ml、2.58×102Copies/ml。每个浓度重复检测3次，以稀释计算值作为理论值，对各浓度稀释样品的实测值与理论值进行回归分析，计算回归方程y=bx+a，相关系数为R2。R2越接近1，表明相关性越好。

1.4统计学处理 采用SPSS22.0统计软件对所有检测数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）来表示，组间比较采用t检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1批内精密度比较 分别采用手工法和全自动法检测样本浓度为3.01×106Copies/ml的高值血清样本和2.54×103Copies/ml的低值血清样本，均值比较，差异具有统计学意义（P＜0.05），全自动法的CV值更小，批内精密度更好，具体见表1。

表1 手工法和全自动法的批内精密度比较

2.2批间精密度比较 分别采用手工法和全自动法检测样本浓度为2.11×106Copies/ml，共检测23次，均值比较，差异具有统计学意义（P＜0.05），全自动法的CV值更小，批间精密度更好，具体见表2。

表2 手工法和全自动法的批间精密度比较

2.3正确度比较 分别采用手工法和全自动法检测浓度为2.0×107Copies/ml、2.0×106Copies/ml、2.0×105Copies/ml、2.0×104Copies/ml、2.0×103Copies/ml的定值血清样本。结果显示，全自动法和手法检测结果存在一定差异，全自动法的CV值更小，具体见表3。

表3 手工法和全自动法的正确度比较（Copies/ml）

2.4线性范围比较 分别采用手工法和全自动法检测浓度为2.58×108Copies/ml、2.58×107Copies/ml、2.58×106Copies/ml、2.58×105Copies/ml、2.58×104Copies/ml、2.58×103Copies/ml定值血清样本及其稀释后的样本进行验证。结果显示，两种方法在检测浓度为2.58×103Copies/ml-2.58×108Copies/ml之间线性范围较好，全自动法R2更接近1，优于手工法，见表4。

表4 手工法和全自动法的线性范围比较

3 讨论

实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）技术是一种准确、快速的核酸定量检测技术，是病原学检测和分子诊断的金标准，已广泛用于医学领域[3]。而核酸提取则是分子生物学的基础和关键[4]。手工法常常利用煮沸法将病毒的DNA直接从病毒颗粒中释放出来，离心后的上清液除了含有核酸，还含有一部分干扰物质，如血红蛋白等[5]。手工法也存在一些生物安全隐患，比如气溶胶[6]等。全自动法以磁珠法应用最多，适合大批量样本检测[7]。磁珠由于能够提供最接近天然抗原递呈细胞的作用而提高了激活能力，简化了核酸提取过程[8]。它的原理是利用磁性硅胶对DNA的特异性吸附，在磁场的作用下可分离获得纯度较高的病毒DNA。

在本研究中，全自动法检测高值血清精密度、低值血清精密度的CV值分别为1.88%、2.50%，明显低于手工法；用2.11×106Copies/ml的高值血清做批间精密度的验证，结果显示全自动法的CV值为2.70%，明显低于手工法；用2.0×107Copies/ml、2.0×106Copies/ml、2.0×105Copies/ml、2.0×104Copies/ml、2.0×103Copies/ml的定值血清样本进行两种核酸提取方法的验证，全自动法的偏倚分别为-1.17%、-1.11%、0.63%、0.58%、-0.98%，CV值均低于手工法。这可能是在操作过程中，操作人员的工作习惯和熟练程度存在差异造成。全自动法提取DNA的过程不需要人参与操作，减少了人工操作的污染以及操作过程中的不确定性，避免了因操作带来的系统误差[9]。对两种操作方法的线性范围对比后发现，两种方法在较宽的线性范围都具有良好的线性；相比较而言，全自动法优于手工法，能更好地满足临床需要，这与马贞丽[10]、董剑[11]等人的报道相一致。

全自动法和手工法都存在一定优缺点。全自动法与手工法相较，主要依靠全自动核酸提取仪以及配套试剂耗材，成本较高；而手工法操作主要依靠于人，不需要仪器，耗材成本也相对较低，但也可能存在一些因操作差异而导致的误差，如高温分解病原体、高速离心、弃除上层废液等环节易出现交叉污染[12]。另外，检验日常工作中避免不了仪器故障，检修常常需要较长时间。此时，手工法就可取而代之。本实验中两种检测方法都能满足日常工作需求，但全自动法优于手工法，手工法可用作全自动法出现故障时的备用。

综上所述，全自动核酸提取法在精密度、正确度、线性范围等方面均优于手工法，简化了工作流程，能更好地满足实验室自动化检测工作，值得推广应用。