李明洋，徐远久，鲁小龙，张雷，苏惠婷，朱珊丽，张友秀

1四川大学华西广安医院检验科，四川广安 638000；2温州医科大学分子病毒与免疫研究所微生物学与免疫学教研室；3四川大学华西广安医院外围手术室

沙眼衣原体是全球细菌性传播感染和可预防性失明的主要病原体[1]。近年来，衣原体传播感染性疾病的发病率迅速增加，以抗生素为主的治疗策略效果不佳。疫苗作为保护和控制传染性疾病最有效的手段，其既能诱导局部中和抗体以防止细胞外的病原体感染，又能诱导细胞介导免疫反应以靶向受感染细胞[1-2]。衣原体主要外膜蛋白（MOMP）疫苗是迄今为止发现的保护性最强的亚单位疫苗[3]。MOMP是存在于沙眼衣原体的原体和始体表面的跨膜蛋白，有四个对称间隔的可变结构域（VDs Ⅰ～Ⅳ），这些结构域序列既是血清分型决定因素，也是中和抗体的体内靶位点[4]。研究表明，MOMP的VD Ⅱ、Ⅳ介导沙眼衣原体黏附宿主细胞，具有较强的免疫原性，含多个潜在抗原表位，可作为重要的免疫原刺激机体产生免疫应答[5-6]。当沙眼衣原体持续性感染时，细胞内沙眼衣原体部分蛋白表达发生改变，但MOMP表达量始终保持在较高水平，故MOMP很可能参与维持沙眼衣原体持续性感染状态[7-8]。因此，开展沙眼衣原体MOMP的研究具有重要意义。2022年1月—6月，本研究运用生物信息学软件预测并分析沙眼衣原体MOMP的蛋白结构及免疫优势表位，为沙眼衣原体感染的诊断及高效表位疫苗的研制奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 MOMP氨基酸序列获取及理化性质分析 登录瑞士生物信息学UniProt蛋白质数据库（https：//www.uniprot.org/），检索E型沙眼衣原体MOMP的氨基酸序列信息。应用EXPASY服务器（https：//www.expasy.org/tools）上的 ProtParam 工具，分析MOMP的氨基酸组成、不稳定性指数等理化性质。

1.2 MOMP的二级结构预测 基于EXPASY服务器上的不同分析方法（SOPMA、GOR），在线预测MOMP的二级结构，如α螺旋、β折叠、β转角和无规则卷曲。

1.3 MOMP的B细胞表位综合分析 基于IEDB（http：//tools.iedb.org/main/bcell/）在线预测软件，预测MOMP蛋白的亲水性参数、表面可及性参数、抗原性参数、柔韧性参数和线性表位参数。结合各预测参数并用吴玉章等建立的抗原性指数（AI）[9]综合分析其B细胞优势表位。

1.4 MOMP的细胞毒性T细胞（CTL）表位综合分析 基于Net CTL（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/）、SYFPEITHI（http：//www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm）、IEDB（http：//tools.immuneepitope.org/main/）在线软件，针对HLA-A*02：01、HLA-A*03及HLA-B*07：02类分子预测MOMP的CTL限制性表位。Net CTL筛选出 COMB＞1.0的九肽，SYFPEITHI筛选出Score＞21的九肽，IEDB筛选出IC50＜50 nmol/L的九肽。

1.5 MOMP的辅助性T细胞（Th）表位综合分析基 于 SYFPEITHI、RANKPEP（http：//imed.med.ucm.es/Tools/rankpep.html）在线软件，针对 HLADRB1*01：01、HLA-DRB1*0301、HLA-DRB1*0401、HLA-DRB1*0701、HLA-DRB1*0801、HLA-DRB1*1101、HLA-DRB1*1501类分子预测MOMP的Th限制性表位。SYFPEITHI中筛选出Score＞21的结果，RANKPEP选取服务器默认结果。

1.6 MOMP的三级结构分析 基于蛋白质结构分析服务器Galaxy（https：//galaxy.seoklab.org/index.html）在线建模分析MOMP的三级结构。

2 结果

2.1 沙眼衣原体MOMP氨基酸序列和理化性质 经ProtParam软件分析，MOMP由393个氨基酸组成，分子式C1874H2916N498O583S21，序列编号P17451，氨基酸序列：MKKLLKSVLVFAALSSASSLQALPVGNPAEPSLMID GILWEGFGGDPCDPCTTWCDAISMRMGYYGDFVF DRVLKTDVNKEFQMGDKPTSTTGNATAPTTLTARE NPAYGRHMQDAEMFTNAACMALNIWDRFDVFCTL GASSGYLKGNSASFNLVGLFGDNENQSTVKTNSVP NMSLDQSVVELYTDTAFSWSVGARAALWECGCAT LGASFQYAQSKPKVEELNVLCNAAEFTINKPKGYV GQEFPLALIAGTDAATGTKDASIDYHEWQASLALS YRLNMFTPYIGVKWSRASFDADTIRIAQPKSATAIF DTTTLNPTIAGAGDVKASAEGQLGDTMQIVSLQLNK MKSRKSCGIAVGTTIVDADKYAVTVETRLIDER AAHVNAQFRF。MOMP结构中占比居前四位的氨基酸分别为丙氨酸（Ala）、苏氨酸（Thr）、亮氨酸（Leu）、甘氨酸（Gly），半胱氨酸（Cys）占比2.9%，易与分子间MOMP形成多聚体形式，维持空间结构稳定性。MOMP不稳定性指数为25.82，蛋白性质相对稳定。MOMP总平均亲水性为-0.088，为亲水性蛋白[9]。

2.2 沙眼衣原体MOMP的二级结构分析结果 应用Expasy服务器上的SOMPA、GOR预测MOMP的二级结构。SOMPA显示其二级结构由39.95%的α螺旋、18.83%的伸展链、37.40%的无规则卷曲、3.82%的β转角构成；GOR显示其二级结构由29.77%的α螺旋、18.32%的伸展链、51.91%的无规则卷曲构成。综合预测MOMP二级结构主要以无规则卷曲为主，出现在23～31 aa、34～37 aa、44～51 aa、84～89 aa、92～99 aa、148～152 aa、171～178 aa、253～264 aa、305～310 aa、324～327 aa、351～356 aa；α 螺旋出现在 7～14 aa、16～21 aa、69～71 aa、111～127 aa、224～233 aa、266～280 aa、330～335 aa、346～351 aa、373～392 aa；少见β转角。

2.3 沙眼衣原体MOMP B细胞表位分析结果基于IEDB服务器上的B细胞表位在线预测工具，MOMP的亲水性系数、表面可及性参数、抗原性参数、柔韧性参数和线性表位预测结果见表1、图1[10-12]。同时结合MOMP二级结构中无规则卷曲可能存在的区段及抗原指数，综合分析推测其B细胞表位可能存在的区域是MOMP的N端GFGGDPCDPCT （42～52 aa）、 DNENQSTVKTNSVPNMSLD（161～179 aa）、TGTKDAS（259～265 aa）和NKMKSRKSCG（349～358 aa）。

表1 沙眼衣原体MOMP B细胞表位的肽段位置预测结果

图1 沙眼衣原体MOMP不同参数预测结果

2.4 沙眼衣原体MOMP限制性CTL表位预测分析结果 将MOMP序列输入3种CTL表位分析软件（Net CTL、SYFPEITHI、IEDB），选择HLA-A*02：01、HLA-A*03及HLA-B*07：02类分子三种MHC Ⅰ限制类型，预测出MOMP的九肽CTL限制性表位。IC50＜50 nmol/L被认为是高亲和力，且数值越低亲和力越高[13]。针对每一种表型，筛选出各软件预测分值均较高且有意义的肽段用作候选CTL表位，具体序列见表2。

表2 沙眼衣原体MOMP的候选CTL表位序列

2.5 沙眼衣原体MOMP Th表位预测分析结果 将MOMP序列输入2种Th表位分析软件（SYFPEITHI、RANKPEP），选择 HLA-DRB1*0101、HLA-DRB1*0301、HLA-DRB1*0401、HLA-DRB1*0701、HLADRB1*0801、HLA-DRB1*1101、HLA-DRB1*1501 类分子7种MHC Ⅱ限制类型，预测出MOMP的9个或15个氨基酸长度的Th限制性表位。针对每一种表型，筛选出各软件预测分值均较高且有意义的肽段，用作候选Th表位[14]。具体序列见表3、表4。

表3 SYFPEITHI预测沙眼衣原体MOMP的候选Th表位序列

表4 RANKPEP预测沙眼衣原体MOMP的候选Th表位序列

2.6 MOMP三维结构及功能结构域预测结果 综合上述预测结果，选择兼有多个表位的氨基酸区域P1（42～65 aa）、P2（155～185 aa）、P3（342～359 aa）作为免疫优势表位（图2A）。在Galaxy WEB在线分析MOMP三级结构，将上述预测的免疫优势表位P1、P2、P3标记于MOMP三维结构中（图2B）。P1区段氨基酸序列为GFGGDPCDPCTTWCDAISMRMGYY，P2区段为LVGLFGDNENQSTVKTNSVPNMSLDQSVVEL；P3区段为 QIVSLQLNKMKSRKSCGI。分析显示，MOMP与其他孔蛋白相似，为桶状三维结构，候选表位位于桶状结构的表面，暴露性较好，易与抗体结合，在蛋白分子构象上符合表位设计要求。

图2 沙眼衣原体MOMP的免疫优势表位及三维结构

3 讨论

沙眼衣原体是一种专性细胞内细菌，主要感染泌尿生殖系统和眼上皮细胞。在一些受感染的女性中，沙眼衣原体迁移到上生殖道，导致慢性无症状感染。目前还没有用于预防沙眼衣原体的商业化疫苗，部分原因在于对感染期间沙眼衣原体引发特异性免疫反应的认知不够深入[2-3]。

沙眼衣原体MOMP能够与宿主蛋白相互作用并抑制吞噬体与溶酶体融合，是疫苗开发的主导方向。MOMP是一类富含半胱氨酸的跨膜蛋白，具有孔蛋白功能，预测有天然的三聚体结构，拓扑模型为β桶结构。因此，很难获得具有完整天然构象表位形式的MOMP。最近报道，基于MOMP VD4区域开发的候选疫苗沙眼衣原体H522可诱导小鼠和人体产生中和抗体。但中和抗体是否足以为女性泌尿生殖道沙眼衣原体感染、发挥保护作用还有待观察[15]。因此，设计表位疫苗最好能覆盖沙眼衣原体的B细胞、CTL、Th表位，不仅可以解决免疫优势问题，还可以产生广泛的免疫应答。

B细胞被认为是适应性免疫系统的核心组成部分，因为其具有识别和提供长期保护免受感染性病原体或肿瘤细胞侵袭的能力，通过产生抗体来执行这些功能。我们通过IEDB服务器中的BepiPred2.0算法对沙眼衣原体MOMP抗原序列进行预测，结合其二级结构、亲水性等，从构象及线性表位进行评估，推测沙眼衣原体MOMP可能的B细胞表位主要集中在MOMP的N端第42～52 aa、161～179 aa、259～265 aa、349～358 aa区段。这些区段多位于无规则卷曲结构中，发生扭曲、折叠的几率较高，易与抗体嵌和[16]。

T细胞免疫疗法可以识别并杀死受沙眼衣原体感染的细胞，为了实施这种疗法，需要考虑到等位基因MHC Ⅰ（HLA）限制性，以更好地满足绝大部分种族群体的抗原识别[17]。我们通过不同算法的MHC Ⅰ类分子在线预测工具，选择了HLA-A*02：01、HLA-A*03、HLA-B*07：02类分子3种MHC Ⅰ限制类型，筛选出预测分值较高且有意义的沙眼衣原体CTL表位。最终获得4个分值较高的HLA-A*02：01限制性表位（177～185 aa、280～288 aa、282～290 aa、318～326 aa）、4个分值较高的HLA-A*03限制性表位（57～65 aa、72～80 aa、342～350 aa、347～355 aa）、1个分值较高的HLA-A*03限制性表位（27～35 aa）。

同样，为了使预测的Th表位有更好的受众性，我们选择亚裔抗原频率较高的HLA-DRB1*01：01、HLA-DRB1*1501、HLA-DRB1*0801、HLA-DRB1*0301、HLA-DRB1*0401、HLA-DRB1*0701、HLADRB1*1101类分子，共7种MHC Ⅱ限制类型[18-20]。通过RANKPEP和SYFPEITHI两种MHC Ⅱ类分子亲和肽预测工具，分别预测9个、15个氨基酸长度的Th细胞表位。不同长度的候选Th表位肽中，两种方法预测结果范围比较接近。SYFPEITHI预测的表位数目较多，且涵盖大部分RANKPEP所预测的九肽，仅在HLA-DRB1*0801表型，RANKPEP单独预测出具有意义的Th细胞表位。

总之，本研究通过生物信息学方法对沙眼衣原体MOMP免疫表位进行预测分析，获得3个免疫优势表位，位于蛋白N端的42～65 aa、155～185 aa区段和C端的342～359 aa区段，为沙眼衣原体筛选新的诊断抗原分子和候选疫苗抗原、拓宽免疫保护范围提供了参考，但上述候选表位肽的实际应用效果还有待于具体实验确认。