孙光慧，郭丛丛，时吉来，杨博文，张珊珊

1山东中医药大学第一临床学院，济南 250355；2山东中医药大学附属医院内分泌科；3济南市中心医院内分泌科

黎明现象是指糖尿病患者在晚间血糖控制良好亦无低血糖的情况下，出现早晨血糖异常升高的现象。黎明现象是血糖波动的重要表现形式，而血糖波动是糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变等糖尿病并发症的独立危险因素[1-2]。研究显示，超过半数的1型糖尿病和2型糖尿病患者存在黎明现象[3-4]。目前黎明现象的防治措施有限，口服降糖药不能充分控制黎明现象，基础胰岛素类似物虽然可以减少黎明现象的发生，但仍存在夜间低血糖的风险。宣白承气汤为清代医学家吴鞠通的代表方剂之一，是宣肺通腑法的典型代表。该方由生石膏、生大黄、杏仁粉、瓜蒌皮组成，可宣肺降气、清热通腑、调理肺大肠经气血运行。目前宣白承气汤对2型糖尿病患者黎明现象的影响相关研究较少。核受体亚家族1组D成员1（Nr1D1）基因是生物钟系统的调控基因之一，在机体的骨骼肌、脂肪、肝脏、单核细胞等中表达，与机体糖代谢密切相关。本研究观察了宣白承气汤联合强化胰岛素治疗2型糖尿病患者黎明现象的效果，并基于与Nr1D1的相互作用，采用分子对接技术筛选宣白承气汤治疗黎明现象的主要成分，为治疗2型糖尿病黎明现象药物的开发提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2018年7月—2021年5月在山东中医药大学附属医院内分泌科住院治疗的2型糖尿病合并黎明现象的患者进入研究。纳入标准：①符合《中国2型糖尿病防治指南（2017年版）》制订的2型糖尿病诊断标准；②符合黎明现象的诊断标准，即空腹血糖与夜间最低点血糖净增值（∂glucose1）≥1.11 mmol/L[4]。排除标准：①夜间出现低血糖反应或苏木杰现象；②近3个月内应用类固醇激素等其他激素药物；③急性糖尿病并发症（糖尿病酮症酸中毒、乳酸酸中毒、高渗性非酮症糖尿病昏迷）、急性心脑血管事件、慢性腹泻、感染、外伤、手术等急性应激状态及肝肾疾病、药物等引起的继发性血糖升高；④患有某些能干扰认知功能评价的疾病；⑤对本研究药物成分过敏及目前处于或准备妊娠、哺乳的妇女。共纳入2型糖尿病患者60例，男32例、女28例，年龄36～ 65（52.57±6.84）岁，糖尿病病程半年至17年。根据性别、年龄、病程、HbA1c水平进行匹配，按照随机数字表法分为对照组和观察组各30例。两组性别、年龄、病程等资料具有可比性。

1.2 治疗方法 入组患者均给予糖尿病健康教育；早、中、晚三餐均按照糖尿病食谱饮食，时间分别为7：00、12：00、17：00；适度强度运动；每天 22：00就寝；戒除烟酒，保持心态平和；在不影响本次试验结果的前提下，对合并有高血压病、高脂血症的患者常规给予降压、降脂药物治疗。根据血糖水平调整降糖药物剂量。治疗3 d。对照组停用口服降糖药，使用门冬胰岛素[诺和诺德（中国）制药有限公司，国药准字S20100049，规格300 U/3 mL]+地特胰岛素[诺和诺德（中国）制药有限公司，国药准字J20090101，规格300 U/3 mL]强化胰岛素治疗。观察组在对照组基础上给予宣白承气汤治疗。宣白承气汤方中生石膏15 g、生大黄9 g、苦杏仁6 g、瓜蒌皮9 g，由山东中医药大学附属医院药剂科提供，水煎400 mL，每日1剂，睡前温服。两组均连续治疗7 d。

1.3 疗效观察 记录两组治疗前后3 d的空腹血糖（FPG）、早餐后2 h血糖（2 h PG）、∂glucose1、早餐后2 h血糖与空腹血糖净增值（∂glucose2）、日内平均血糖（MBG）、日内血糖波动幅度（MAGE）。

1.4 中药作用机制分析

1.4.1 中药主要活性成分的获取 以“大黄”“苦杏仁”“瓜蒌”为关键词，利用中药系统药理学数据库与分析平台TCMSP数据库（http：//www.tcmspw.com）检索获得三种药物的所有化学成分，以口服生物利用度＞30%、类药性＞0.18条件筛选宣白承气汤的活性成分[5]。使用Cytoscape3.8.2软件绘制中药—活性成分—靶点的网络图。

1.4.2 中药主要活性成分与Nr1D1蛋白靶标的分子对接 在TCMSP和PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中搜索化合物的二维结构信息，并通过Chem3D19.0软件将其转换为3D结构。从PDB数据库（http：//www.rcsb.org/）中下载靶蛋白Nr1D1（PDB ID：1A6Y）的3D结构。应用Maestro11.5软件进行对接。用模块Protein preparation wizard对1A6Y结构进行修正化学键序，加氢，处理二硫键、金属离子，删除晶体结构中水分子、杂原子等预处理；使用Ligprep模块处理配体，对化合物分子进行加氢等优化预处理；在力场OPLS3下，计算pH 7.0±2.0的化合物离子状态，搜索合理构象作为对接起始构象，形成可能的互变异构体，并生成批量处理文件；使用Receptor Grid Generation模块创建蛋白质受体网格点，确定活性口袋坐标；采用Ligand Docking模块对接已制备好的受体与配体，在Receptor grid file中导入将格点文件，对所有化合物进行分子对接，参数设为默认值。Docking score是受体与配体对接的打分值，分值越小说明受体亲和力越强，两者结合越牢固，以分值＜-5作为初步筛选条件[6]。

1.5 统计学方法 采用SPSS32.0统计软件。计量资料以±s表示，组间比较采用t检验。计数资料采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组疗效比较 两组治疗后FPG、2 h PG、∂glucose1、MBG、MAGE均较治疗前降低，且观察组低于对照组（P均＜0.01）。两组治疗后∂glucose2较治疗前相比无明显差别（P＞0.05），但观察组低于对照组（P＜0.05）。见表1。对照组发生低血糖1例（3.3%），观察组发生低血糖0例（0%），观察组低血糖发生率低于对照组（P＜0.05）。

表1 两组治疗前后FPG、2 h PG、∂glucose1、∂glucose2、MBG、MAGE比较（mmol/L，±s）

表1 两组治疗前后FPG、2 h PG、∂glucose1、∂glucose2、MBG、MAGE比较（mmol/L，±s）

注：与同组治疗前相比，**P＜0.01；与对照组治疗后相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

2 h PG n FPG ∂glucose1∂glucose2MBG MAGE 组别观察组治疗前治疗后对照组治疗前治疗后30 8.41±0.83 6.32±0.83**##10.22±0.97 8.19±0.58**##3.24±1.06 1.38±0.74**##1.81±0.75 1.87±0.68#8.01±0.53 6.75±0.41**##5.05±1.01 3.25±0.60**##30 1.97±1.14 2.12±0.89 8.39±0.71 7.15±0.76**10.35±1.034 9.27±1.071**3.01±1.07 1.97±0.68**8.16±0.50 7.57±0.65**4.97±1.20 4.09±1.07**

2.2 中药作用机制分析结果 筛选得到宣白承气汤的45种主要活性成分，其中瓜蒌11个、杏仁18个、大黄16个。将筛选出的宣白承气汤的45种活性成分和Nr1D1蛋白靶标进行对接，根据对接结果（表2），Docking score绝对值大于5.0的受体化合物有15个，其中11个成分来自大黄（MOL000554、MOL002280、MOL002260、MOL002259、MOL002288、MOL002235、MOL002268、MOL000096、MOL002281、MOL002293、MOL002276），3个成分来自杏仁（MOL000492、MOL007202、MOL010921），1个成分来自瓜蒌（MOL002881），3味中药均可通过活性成分作用于Nr1D1，以君药大黄的作用最为显著。Docking score最高的前5个成分均来自大黄（Docking score＜-6）。这5个成分与Nr1D1对接构象见OSID码图1，其中共同的活性口袋（即主要作用的活性位 点）有 PHE111、ARG172、GLY174、TYR113、LYS122、ARG126、TYR113、GLY174、GLU119、PHE173、SER109和HID112。

表2 宣白承气汤活性成分与Nr1D1分子对接结果

3 讨论

本次研究结果提示，宣白承气汤联合强化胰岛素治疗优于单纯应用强化胰岛素治疗，不仅可有效降低合并黎明现象2型糖尿病患者的FPG、减少日间血糖波动，还可降低低血糖风险。分子对接技术可模拟分子结构及分子间作用，寻找受体与配体间作用的最佳构象，以化学计量形式预测结合的模式和亲和力。分子对接技术能够快速筛选发现药用成分与潜在靶点，对于一些疾病的新靶点研究与新药研发具有重要意义。本研究运用分子对接技术，将筛选的宣白承气汤45种化学成分与2型糖尿病黎明现象发病机制中的关键靶点Nr1D1进行对接，发现宣白承气汤有15个成分与关键靶点Nr1D1有良好的结合活性，其中对接活性最强的5个成分[没食子酸-3-O-（6'-O-没食子酰基）-葡萄糖苷、芦荟大黄素8-O-β-D-（6'-oxayl）-葡萄糖苷、原花青素 B-5，3'-O-没食子酸酯、大黄素甲醚双葡萄糖苷、大黄素-1-O-β-D-吡喃葡萄糖苷]均来自君药大黄。这提示大黄在治疗黎明现象方面具有潜在优势。

目前，黎明现象确切的发生机制还不完全清楚。医学界普遍认为，黎明现象是在胰岛β细胞功能减退的基础上，清晨内源性葡萄糖产量增加和持续性胰岛素抵抗共同作用的结果[7-8]，而肝脏糖异生增强则是内源性葡萄糖产量增加的主要原因[8]。近年来生物钟系统对机体糖脂代谢的调节成为研究热点。研究发现，正常生理状态下，葡萄糖耐量、糖原储存、胰岛素分泌、胰岛素敏感性等均表现出一定的昼夜节律，肝脏糖异生也不例外，肝脏糖异生在觉醒前后达到高峰，以防止睡眠中出现低血糖，并为觉醒后的活动提供能量[9]。肝脏糖异生同时受中枢生物钟及肝脏生物钟的调控[10]。

中枢生物钟系统位于前下丘脑的视交叉上核（SCN），通过感知光照维持机体24 h的生物钟周期性变化，为机体内其他外围时钟设定了基线时间[10]。SCN将“时间信息”传递给其他组织器官及细胞，从而实现外周组织生物钟的同步化。SCN区GABA神经元（SCNGABA）中富集着Nr1D1基因，该基因是生物钟系统及机体代谢的中央调节器。近期相关研究证实，SCNGABA中的Nr1D1控制着肝脏胰岛素的昼夜敏感性，是调控肝脏糖异生、导致黎明现象的关键基因。与无黎明现象患者相比，黎明现象患者Nr1D1节律表达异常，于19：00～1：00活性呈下降趋势。敲除中枢生物钟系统Nr1D1基因表达，可导致小鼠黎明现象发生[11]。磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1（PCK1）是糖异生过程中的限速酶[12]，肝脏中过表达PCK1会导致糖异生亢进、血糖升高，导致黎明现象的发生。YUAN等[13]研究发现，Nr1D1通过与基因启动子中的特异反应元件（一个RevRE位点）结合，直接抑制肝脏PCK1的转录，降低空腹血糖。这提示于该时段干预黎明现象患者的Nr1D1活性可能通过PCK1调节肝脏糖异生。

中医认为，人体是一个有机整体，其处于阴阳平衡的状态，阴阳失调则变生疾病。外界环境的空间或时间变化会对人体生理活动和疾病的发生有重大影响。在中医理论中，肺朝百脉，指肺通过呼吸运动，调节全身气机，促进血液运行；肺主治节，指肺气具有治理调节肺之呼吸及全身之气、血、水的作用。由此可见，肺气对机体的影响与Nr1D1对生命生物钟的影响有着相通之处。中医理论认为，一天十二时辰分别对应十二经脉，人体气血按照各时辰依次流注于各经络脏腑，其中日落至清晨的6个时辰分别为戌时（19：00～21：00，对应心包经）、亥时（21：00～23：00，对应三焦经）、子时（23：00～1：00，对应胆经）、丑时（1：00～3：00，对应肝经）、寅时（3：00～5：00，对应肺经）和卯时（次晨5：00～7：00，对应大肠经）。根据中医的子午气血流注的整体观念，血糖波动是人体气血流注异常的一种表现形式[14]。黎明现象发生在清晨，具有明显的时间特征，对应子午流注寅、卯时，是肺与大肠经气血流注盛时[15]。因此，肺、大肠气血流注异常可能是造成黎明现象的关键病机。临床经验发现，宣白承气汤在晚饭至睡前服用疗效较好，我们推测这可能与宣白承气汤激活Nr1D1的活性有关，从而调畅了清晨的气血流注，抑制黎明现象。

宣白承气汤为清代医学家吴鞠通的代表方剂之一，由生石膏、生大黄、杏仁粉、瓜蒌皮组成。方中以生石膏入肺经，清热泻火、除烦止渴，生大黄入大肠经，攻下腑实，共为君药；苦杏仁入肺与大肠经，善降气，具有降气平喘、润肠通便之功；瓜蒌皮入肺经，具有清热润肺化痰之功，二者共为臣药。腑实得下，则肺热易清，肺气清肃，则腑气亦通。大黄是该方的君药。现代药理学研究表明，大黄有效成分大黄素、大黄酸、番泻苷等可通过不同靶点降低胰岛素水平、提高胰岛素敏感性、纠正胰岛素抵抗。其中，大黄酸可以通过减少碳水化合物吸收来减轻胰岛素抵抗，通过改变糖尿病小鼠肠道菌群而纠正糖代谢紊乱[16-18]。

生石膏是宣白承气汤的另一君药，主要成分为含水硫酸钙，味辛、甘，性大寒，清热泻火、除烦止渴。有研究发现，Ca2+在SCN神经元中传递核心生物钟的输入和输出信号，是生物钟重置的关键分子，对生物钟的光反应至关重要[19]。血糖代谢及相关激素分泌等生理过程具有昼夜节律。口服石膏可以增加血清Ca2+浓度[20]，加快生物钟调整反应速度，减少昼夜节律紊乱的影响。杏仁与瓜蒌皮是宣白承气汤中的臣药。刘雪峰等[21]通过动物实验发现，杏仁多肽与杏仁多肽能有效调节糖尿病大鼠血糖，对糖尿病具有辅助治疗效果。王岁岁[22]通过动物实验发现，瓜蒌皮可能通过改变糖尿病小鼠肠道微生物群而改善糖尿病小鼠的糖脂代谢，实现降低血糖、纠正胰岛素抵抗的作用。

综上所述，本研究基于临床研究和分子对接的方法对宣白承气汤辅助治疗糖尿病患者黎明现象的效果及机制进行了探索。研究结果显示，宣白承气汤联合强化胰岛素疗效显著，可抑制2型糖尿病患者的黎明现象，减少日间血糖波动。该方以君药大黄为主的活性成分与Nr1D1有较强的对接活性，其对接位点的信息为宣白承气汤的临床应用和未来实验研究提供了科学依据。