徐彦楠，赵青 ，赵俊霞，周娜静，高品，周晨明

1河北医科大学教学实验中心，石家庄 050017；2河北医科大学第四医院眼科；3河北医科大学细胞生物教研室；4河北医科大学大型科研仪器设备共享服务平台

肝癌是常见的恶性肿瘤之一，病死率较高，严重威胁患者生命健康安全[1]。尽管近年来乙肝疫苗得到普及、人们生活水平明显提高，但我国肝癌发病率仍相对较高[2]。临床治疗肝癌以化疗为主要手段，但不良反应较重、易产生耐药性，治疗效果不佳[3]，迫切需要寻找和研发新型高效的抗肝癌药物。近年来研究发现，一些中药提取物能通过影响肿瘤细胞凋亡而表现出抗肿瘤作用，且呈多靶点作用，毒性较小，特异性强[4]。异牛肝菌素是一种从褐环粘盖牛肝菌中分离得到的单体化合物，与之前研究发现的牛肝菌素是同分异构体，属于聚异戊二烯酚类化合物[5]。临床研究表明，异牛肝菌素对多种肿瘤细胞具有抑制作用，如人胃癌BGC-823细胞株、人肺腺癌A549细胞株、人慢性髓系白血病K562细胞株等，且对正常淋巴细胞无毒性作用[6-8]。但异牛肝菌素对人肝癌HepG2细胞株的作用及机制鲜有报道。2021年1月—12月，本研究观察了异牛肝菌素对人肝癌细胞株HepG2增殖和凋亡的影响，并基于磷脂酸肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）通路探讨相关作用机制，为新型抗肿瘤药物的研制提供参考。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要实验材料 人肝癌细胞株HepG2购于北京晶莱华科生物技术有限公司。异牛肝菌素由河北师范大学生命科学学院提供，浓度≥98%，实验前用完全培养液稀释为50.0µg/mL；PI3K/Akt通路激活剂Fumonisin B1购于上海源叶生物科技有限公司；DMEM培养基购于美国Invitrogen公司；胎牛血清购于美国Gibco公司；青霉素、链霉素购于上海依赫生物科技有限公司；鼠抗人Bax单克隆抗体购于艾美捷Trevigen公司；鼠抗人Bcl-2单克隆抗体购于上海翌圣生物科技股份有限公司；兔抗人Caspase-3单克隆抗体购于北京百奥博科技有限公司；兔抗人PI3K、pPI3K、pAkt单克隆抗体购于英国Abcam公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗购于石四药-翰林生物公司；乙二胺四乙酸（EDTA）购于美国Sigma公司；内参兔β-actin多克隆抗体购于武汉博士德生物工程有限公司。MTT试剂盒购于上海齐源生物科技有限公司；Hoechst333258购于上海士锋生物科技有限公司；RIPA裂解液购于上海康郎生物科技有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购于武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；细胞培养箱（型号AHW-80L）购于上海目尼实验设备有限公司；振荡器（型号ZW-A）购于苏州市国飞实验室仪器有限公司；全自动酶标仪（型号ELX900）购于美国Bio-Tek公司；Odyssey双色红外荧光成像系统购于美国LI-COR公司；BX51荧光倒置显微镜购于日本Olympus公司。

1.2 细胞分组与异牛肝菌素用法 HepG2接种于含 10%FBS、青霉素（100 U/mL）、链霉素（100 U/mL）的DMEM培养基，置于细胞培养箱中培养，培养箱条件为适宜饱和湿度、37℃、5% CO2。定期更换培养液，待细胞培养至80%～90%密度时，弃培养液，用PBS洗涤细胞2次，加入0.04%EDTA消化液5 mL，混匀后吸去胰酶溶液，37℃下放置5 min，再加入2 mL含10%FBS的新鲜DMEM培养液终止消化，反复吹打使细胞形成单细胞悬液，传代培养至80%～90%密度待用。将细胞分为异牛肝菌素组、激活剂组、对照组。取第三代对数生长期的HepG2细胞，调整细胞浓度至6×107/L，胰酶消化，接种于96孔培养板、100µL/孔，每组设置6个复孔。将接种好的培养板置入培养箱（适宜饱和湿度、37℃、5% CO2）中培养，待细胞完全贴壁后，弃去旧培养液。异牛肝菌素组加入50µg/mL的异牛肝菌素；激活剂组加入50µg/mL的异牛肝菌素和20µg/mL的Fumonisin B1；对照组为细胞悬液，仅加入等容量生理盐水，不加任何药物。

1.3 细胞增殖抑制率测算 各组细胞培养24、48、72 h后弃去培养液，每孔加入新鲜培养液100µL，避光条件下加入5 mg/mL的MTT液10µL，避光条件下孵育4 h，每孔加入DMSO 150µL，然后置于振荡器上，于室温下振荡10 min。采用酶标仪于450 nm波长处检测光密度（OD）值，重复测量3次。计算HepG2细胞增殖抑制率。增殖抑制率（%）=（1-实验组平均OD值/对照组平均OD值）×100%。

1.4 细胞凋亡情况观察 各组细胞培养72 h后弃去培养液，采用4%中性甲醛固定细胞20 min，弃去固定液，PBS洗涤2次，吸尽液体；每孔加入Hoechst333258染液100 µL，室温下染色10 min，吸尽染液，PBS洗涤2次；每孔加入适量荧光淬灭剂，于荧光倒置显微镜下观察并拍照，细胞核明显浓缩为凋亡细胞，计算细胞凋亡率。细胞凋亡率（%）=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.5 细胞中凋亡相关蛋白及PI3K/Akt通路相关蛋白检测 采用Western blotting法。各组细胞培养72 h后弃去培养液，终止培养，收集细胞，用PBS洗涤2次，吸尽液体；加入事先预冷的RIPA裂解液，于4℃下裂解细胞30 min；提取各组细胞总蛋白，将蛋白质溶液与等量上样缓冲液混合，经10% SDSPAGE电泳后转至NC膜上，5%脱脂奶粉37℃封闭3 h；分别加入 Bax、Bcl-2、Caspase-3、PI3K、pPI3K、pAkt单克隆抗体，在4℃下孵育过夜，TBS漂洗1次；添加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗，于37℃下孵育2 h，TBS漂洗3次；滴加事先按1∶1混合好的化学发光液，室温孵育3 min，吸去多余的化学发光试剂，将NC膜放入凝胶成像系统中进行发光、照相，测定各蛋白条带的积分光密度（IOD）值。以目的蛋白条带IOD值与β-actin条带IOD值的比值表示目的蛋白相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.6 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。采用K-W检验分析计量资料正态分布性，符合正态分布的计量资料以±s表示，多组比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞OD值与增殖抑制率比较 干预24、48、72 h后，异牛肝菌素组细胞OD值低于激活剂组与对照组，细胞增殖抑制率高于激活剂组与对照组（P均＜0.05）。随时间延长，异牛肝菌素组OD值呈降低趋势，细胞增殖抑制率呈升高趋势；对照组与激活剂组OD值呈增高趋势（P均＜0.05）。详见表1。

表1 干预不同时间各组细胞OD值及增殖抑制率比较（±s）

表1 干预不同时间各组细胞OD值及增殖抑制率比较（±s）

注：与同组干预24 h后相比，aP＜0.05；与同组干预48 h后相比，bP＜0.05；与同时点对照组、激活剂组相比，cP＜0.05。

组别异牛肝菌素组激活剂组对照组OD值增殖抑制率（%）72 h 87.68±0.51abc 0.00±0.00 0.00±0.00 24 h 0.302±0.001c 1.239±0.002 1.241±0.003 48 h 0.258±0.001ac 1.392±0.002a 1.394±0.002a 72 h 0.179±0.001abc 1.441±0.002a 1.443±0.003a 24 h 76.37±1.12c 0.00±0.00 0.00±0.00 48 h 81.56±0.89ac 0.00±0.00 0.00±0.00

2.2 各组细胞凋亡率及凋亡相关蛋白表达比较 异牛肝菌素组、激活剂组、对照组细胞凋亡率分别为68.37% ±2.16%、6.01% ±0.69%、6.12% ±0.72%，异牛肝菌素组细胞凋亡率高于激活剂组和对照组（P均＜0.05）。异牛肝菌素组细胞Bax、Caspase-3蛋白表达高于激活剂组和对照组，Bcl-2蛋白表达低于激活剂组和对照组（P均＜0.05）。见表2、图1。

表2 各组细胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达比较（±s）

表2 各组细胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达比较（±s）

注：与对照组相比，aP＜0.05，与激活剂组相比，bP＜0.05。

组别异牛肝菌素组激活剂组对照组Caspase-3 0.67±0.01ab 0.28±0.03 0.26±0.02 Bax 0.58±0.04ab 0.18±0.02 0.17±0.01 Bcl-2 0.34±0.02ab 0.86±0.09 0.87±0.08

图1 各组细胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达情况

2.3 各组细胞中PI3K/Akt通路相关蛋白表达比较 异牛肝菌素组PI3K、pPI3K、pAkt蛋白表达低于激活剂组和对照组（P均＜0.05）。见表3、图2。

表3 各组细胞中PI3K、pPI3K、pAkt蛋白表达比较（±s）

表3 各组细胞中PI3K、pPI3K、pAkt蛋白表达比较（±s）

注：与对照组相比，aP＜0.05，与激活剂组相比，bP＜0.05。

组别异牛肝菌素组激活剂组对照组PI3K 0.54±0.03ab 0.83±0.09 0.85±0.07 pPI3K 0.53±0.02ab 0.82±0.05 0.83±0.04 pAkt 0.51±0.01ab 0.78±0.08 0.79±0.06

图2 各组细胞中PI3K、pPI3K、pAkt蛋白表达情况

3 讨论

肝癌是是常见的消化道恶性肿瘤，病死率较高，严重危及患者生命安全，因此肝癌的防治工作仍任重道远[9]。早期肝癌患者可接受外科手术切除治疗，效果相对较好，5年生存率在40%～70%。但肝癌起病较为隐匿，早期通常没有症状或症状不典型，确诊时多已发展至中晚期，导致患者失去手术治疗的机会[10-12]。中晚期肝癌治疗以化疗为主，但化疗会产生严重的不良反应，有30%～80%的患者出现肿瘤耐药[13]。基于此，寻找新型、高效、毒性低的抗肝癌药物具有重要意义。

肝癌细胞无限生长的原因在于肿瘤细胞增殖失控与凋亡受阻。细胞凋亡是维持机体正常生命活动必不可少的程序，而肿瘤细胞凋亡障碍能较大程度地影响肿瘤的发生发展。如何促使肿瘤细胞凋亡在肿瘤治疗中意义重大[14]。通过诱导肿瘤细胞凋亡而控制肿瘤生长，是目前多数抗肿瘤药物的主要作用机制之一。褐环粘盖牛肝菌是一种食用兼药用的大型真菌，异牛肝菌素是从其中提取的一种天然化合物。异牛肝菌素表现出较强的生物活性，其在体外能通过诱导肿瘤细胞凋亡发挥抗肿瘤作用[15]。本研究观察了异牛肝菌素对人肝癌HepG2细胞增殖的影响，结果显示，异牛肝菌素组随用药时间延长而OD值减小、细胞增殖抑制率升高，且异牛肝菌素组细胞增殖抑制率高于激活剂组和对照组。同时，Hoechst333258荧光染色结果显示，对照组与激活剂组细胞形态正常，呈蓝色荧光，分布均匀，异牛肝菌素组同一视野下细胞数目明显减少，被染成亮蓝色，核固缩，染色质凝聚，有凋亡小体出现，呈现细胞凋亡的形态学改变。异牛肝菌素组细胞凋亡率高于激活剂组和对照组。上述研究结果提示，异牛肝菌素对人肝癌HepG2细胞具有较强的抑制效果，有成为新型抗肿瘤药物的可能。

研究表明，Bcl-2家族蛋白和Caspase家族蛋白与细胞凋亡密切相关。Bcl-2蛋白存在于线粒体膜，能保护膜通透性，同时能与Bax形成异源二聚体，抑制Bax的促凋亡活性。因此，Bax/Bcl-2比值能反映Bcl-2家族蛋白对细胞凋亡的调控作用[16]。Caspase家族中的Caspase-3蛋白参与细胞凋亡启动和执行过程，其表达量能反映Caspase家族蛋白对细胞凋亡的调控作用，亦是参与细胞凋亡最重要的调控蛋白[17]。本研究结果显示，异牛肝菌素组细胞中Bax、Caspase-3蛋白表达高于激活剂组和对照组，Bcl-2蛋白表达低于激活剂组和对照组，这提示异牛肝菌素可能通过调控Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达从而发挥促进肝癌细胞凋亡的作用。

PI3K/Akt信号通路是参与细胞生长、代谢、凋亡及转移的重要调节通路，其在多数肿瘤细胞内表达失调[18]。临床研究表明，肝癌的发生发展与PI3K/Akt信号通路关系密切[19]。PI3K 是 PI3K/Akt信号通路的核心，能够特异性催化磷酸肌醇-3-位羟基磷酸化，产生肌醇脂物质，进一步激活或募集通路下游靶蛋白产生一系列信号级联反应。Akt被激活后能从胞质转移至胞膜，并促进磷酸化的发生，进而激活或抑制PI3K/Akt信号通路的下游靶蛋白，从而调节细胞增殖或凋亡过程[20]。鉴于此，本研究基于PI3K/Akt信号通路探讨异牛肝菌素对人肝癌细胞增殖、凋亡的调控机制，结果显示，异牛肝菌素组细胞PI3K、pPI3K、pAkt蛋白表达低于激活剂组和对照组，提示异牛肝菌素抑制肝癌细胞增殖并诱导其凋亡的作用可能与抑制PI3K/Akt信号通路相关。同时，激活剂组与对照组PI3K、pPI3K、pAkt蛋白表达无统计学差异，提示PI3K/Akt通路被激活后，异牛肝菌素无法再发挥诱导细胞凋亡的作用。结合上述研究结果，我们认为，异牛肝菌素可抑制HepG2细胞增殖并诱导其凋亡，作用机制可能与抑制PI3K/Akt通路有关。