◎ 马 芳，王丽杰

（河南中测技术检测服务有限公司，河南 郑州 450000）

我国最新国家标准方法《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》（GB 4789.2—2016）[1]规定菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得1 g（或1 mL）检样中形成的微生物菌落总数。

食品中菌落总数测定是用来判定食品被细菌污染的程度的标志，它反映食品在生产过程中是否符合卫生标准，在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣[2-3]。通过测定菌落总数，可以观察其在食品中的生长繁殖变化，为市场监督管理评价，提供重要依据。所以，测定食品中的菌落总数意义重大。目前，国内食品微生物实验室均按照国家标准GB 4789.2—2016来检测菌落总数。在日常检测时，因受多种因素的干扰，影响到检测数据及结论的准确性、可靠性。

2018年9月1日实施《检测和校准实验室能力认可准则》（CNAS—CL01：2018）[4]。新版准则中对方法验证的实施从岗位职责的设置、人员能力的要求、人员授权，到技术能力的验证提出了明确要求。然而很多实验室在实施方法验证过程中，由于对准则理解不透彻，对方法验证概念及技术操作的理解不全面，导致其在实施方法验证过程中存在很多不足，因而不能准确完成方法验证，无法满足认可准则的要求或检测标准方法的要求[5]。因此需对检测方法进行验证，排除干扰因素，提供客观数据，以证明实验室可以准确使用该检测方法，确保所用方法的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品和标准菌株

取3种不同基质样品：大辣棒（调味面制品）、蛋白固体饮料、多维三合一核桃粉（经灭菌处理，样品空白默认为0），分别标记为Y1、Y2、Y3；大肠埃希氏菌（ATCC 29522）作为人工污染菌株，购买于山东拓普生物工程有限公司（附有质量检测报告），菌种验收合格。

1.1.2 培养基及试剂

平板计数琼脂（Plate Count Agar）（青岛海博）、含225 mL的0.85%生理盐水均质袋（青岛海博）。

按照（GB 4789.28—2013）表E.1对平板计数琼脂进行技术性验收，大肠埃希氏菌（ATCC25922）、金黄色葡萄球菌（ATCC6538）、枯草芽孢杆菌（ATCC6633）半定量值G分别为12、10、10，满足G≥6，培养基技术验收合格，满足培养基使用需求。

1.2 仪器与设备

YXQ-70A立式压力蒸汽灭菌锅（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；BSC-1500IIA2-X 生物安全柜（济南鑫贝西生物）；SPX-250B-Z 生化培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；HN-08拍打式无菌均质器（上海汗诺仪器有限公司）。

仪器设备校准机构：方圆检测认证有限公司，具有校准、检测资质；仪器设备校准、检测结果符合使用标准要求。

1.3 实验方法

1.3.1 样品制备

（1）菌液的制备。挑取大肠埃希氏菌标准菌株（ATCC29522）磁珠于10 mL脑心浸出液（Brain Heart Infusion，BHI）中，36 ℃培养18～24 h，待用。

（2）稀释液对照组制备。取10 mL的2.4.1中菌液加入90 mL生理盐水中，混匀，进行10倍系列稀释。

（3）样品验证组制备。取25 g样品Y1、Y2、Y3加入225 mL生理盐水中，均质混匀。

1.3.2 稀释液对照组

分别取1.3.1中的10倍系列稀释度中的10-3～10-6样液各1 mL，注入两个平皿中，同时移取稀释液作空白对照。及时将冷却至46 ℃的PCA培养基15～20 mL倾注平皿，并呈8字形晃动平皿使样液混合均匀。置水平台面待培养基完全凝固，倒置放入36 ℃培养箱中进行培养，重复测定6次数据，测定结果见表1。

1.3.3 样品验证组

分别取1.3.1中的10倍系列稀释度中的10-3～10-6样液各1 mL，注入两个平皿中，再在平皿中注入1.3.1中10倍系列稀释度中的10-3～10-6样液各1 mL，每个稀释度注入两个平皿，同时移取稀释液作空白对照。及时将冷却至46 ℃的PCA培养基15～20 mL倾注平皿，并呈8字形晃动平皿使样液混合均匀。置水平台面待培养基完全凝固，倒置放入36 ℃培养箱中进行培养。重复测定6次数据，测定结果见表1。

2 结果与分析

2.1 菌落数测定

由表1可知，选取菌落数在30～300的平板，计算平板菌落数平均值，依据GB 4789.2—2016中7.1.2进行计算。对照组和样品组Y1、Y2、Y3稀释度10-5与10-6呈现梯度稀释倍数关系，符合相关要求。

表1 不同稀释度的样品菌落数表（单位：CFU·g-1）

2.2 环境条件

环境监测数据结果如表2。实验室为万级无菌室，设有恒温恒湿设施，结果表明，符合《实验室质量控制规范 食品微生物检测》（GB/T 27405—2008）的标准要求。

表2 无菌间环境监测数据表

2.3 估计偏差

样品验证组与对照组估计偏差R计算公式为

式中：R为估计偏差；A为对照组菌落数，CFU·g-1；B为样品验证组菌落数，CFU·g-1。

计算R1、R2、R3的估计偏差分别为0.017 7、0.049 2、0.064 5，以上R均＜0.5，符合RB/T 033—2020规定偏差要求。

2.4 精密度

按全程序对稀释对照组和样品验证组Y1、Y2、Y3平行测定6次，测定及统计结果见表1，精密度验证结果见表3。以上结果表明，稀释液对照组和样品验证组Y1、Y2、Y3相对偏差均小于10%，满足实验要求。

表3 精密度验证结果表

3 结论

本实验室人员、仪器设备设施、培养基、试剂、菌种和环境条件等实验条件均满足《检测和校准实验室能力认可准则》（CNAS—CL01：2018）要求。通过对不同基质样品人工污染，进行菌落总数的检测，验证结果表明，估计偏差、精密度、梯度线性等满足标准方法要求；标准方法可操作性强，满足实验要求。验证结论：本检测机构有能力满足开展《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》（GB 4789.2—2016）检测的各项要求，可以开展此项检测工作。