◎ 胡海燕

（好丽友食品（上海）有限公司，上海 201707）

固体食品如糕点类、饼干类及膨化类等产品按照国家标准方法检测菌落总数时，稀释后的样品匀液中含有较多小颗粒样品料渣或者白色油脂颗粒不能完全溶解，此样品料渣在结果计数时呈现和乳白色菌落相似状态，可能会被误读为菌落，对菌落计数有一定的干扰，影响结果的准确性。

红四氮唑，化学名为2,3,5-三苯基氯化四氮唑（2,3,5-trihenylterzoliumchloride，TTC），分子式为C19H15ClN4，是一种脂溶性光敏感复合物。TTC水溶液无色，能被嗜中温性需氧菌在新陈代谢过程中产生的琥珀脱氢酶的氢结合产生红色的三苯甲臢（TPF），因此使菌落呈现红色，与样品的白色料渣明显区分，使菌落总数计数的准确性提高[1-2]。

1 材料与方法

1.1 试验试剂

红四氮唑（TTC）：分析纯，上海展云化工有限公司；菌落计数琼脂（PCA）：北京陆桥技术股份有限公司；食盐：中盐上海市盐业公司；标准菌株：ACAS-PT1080，中国检验检疫科学研究院测试评价中心。

1.2 试验仪器

AND-EK6100i电子秤；interscience BAGMIXER400均质器；超净工作台：苏净安泰空气技术有限公司；GR85DA灭菌锅：致微（厦门）仪器有限公司；PALL过滤除菌膜：0.2 μm；赛多利斯电子单道移液器；上海博迅隔水式电热恒温培养箱；GZX-9240MBE博迅电热鼓风干燥箱。

1.3 试验方法

1.3.1 TTC制备

称取1.0 g TTC溶解于100 mL无菌的蒸馏水中，使用0.2 μm的滤膜过滤除菌后置于经过121 ℃、15 min高压蒸汽灭菌的玻璃瓶内，瓶外包裹锡箔纸避光保存，使用时按照所需配制成适宜的浓度进行试验[3]。

1.3.2 试验试剂的制备

菌落计数琼脂（PCA）：称取23.5 g培养基于1 L蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，121 ℃高压灭菌15 min，冷却至46 ℃左右备用[4]。

0.85%生理盐水：称取8.5 g食盐于1 L蒸馏水中，完全溶解，121 ℃高压灭菌15 min，冷却至常温备用[5]。

1.3.3 TTC显色特征分析

已接种固定浓度细菌的奶粉和0.85%生理盐水制成菌悬液，将菌悬液按照10倍稀释，用均质器拍打2 min制成样品匀液，然后按照1∶10、1∶100进行梯度稀释，每个梯度做2个平行，共做8组，最后分别用含有0%、0.000 4%、0.001 0%、0.002 0%、0.004 0%和0.008 0%TTC的菌落计数琼脂倾注平板，凝固后倒置于（36±1）℃培养24 h后观察菌落形态。

1.4 TTC使用浓度分析

1.4.1 不同浓度TTC应用于糕点类产品的菌落总数检测

分别准备含有不同菌量的糕点类制品，即糕点1、糕点2和糕点3。将以上样品均按照10倍稀释溶解，用均质器拍打2 min制成样品匀液，然后分别按照梯度稀释1∶10、1∶100进行试验，每个样品及试验梯度做两个平行。最后分别用不含TTC的PCA和分别含有0.000 1%、0.000 5%、0.001 0%、0.001 5%和0.002 0%TTC的PCA培养基进行倾注平板，待平板凝固后倒置于细菌培养箱内，（36±1）℃下培养24 h，对平板上菌落进行计数[6]。

1.4.2 不同浓度TTC应用于饼干制品的菌落总数检测

分别准备含有不同饼干类制品，即饼干1、饼干2和饼干3。将以上样品均按照10倍稀释溶解，用均质器拍打2 min制成样品匀液，然后分别按照梯度稀释1∶10、1∶100、1∶1 000进行试验，每个样品及试验梯度做2个平行。最后分别用不含TTC的PCA和分别含有0.000 1%、0.000 5%、0.001 0%、0.001 5%和0.002 0%TTC的PCA培养基进行倾注平板，待平板凝固后倒置于细菌培养箱内，（36±1）℃下培养24 h，对平板上菌落进行计数[6]。

1.4.3 TTC最佳使用浓度分析

配制不同浓度的菌悬液3份，分别使用未添加TTC和添加了0.001%、0.002%、0.003%、0.004%和0.005%的菌落计数琼脂进行检测，对每个样品的结果进行分析，选择TTC的最佳使用浓度。

1.5 TTC应用于不同类型产品菌落总数检测

分别准备含有不同菌量的糕点产品、饼干产品。将以上样品均按照10倍稀释溶解，用均质器拍打2 min制成样品匀液，然后分别按照梯度稀释1∶10、1∶100进行试验，每个样品及试验梯度做2个平行。最后分别用不含TTC的PCA和含有0.001%TTC的PCA培养基进行倾注平板，待平板凝固后倒置于细菌培养箱内，（36±1）℃下培养24 h，对平板上菌落进行计数，并观察菌落形态。

为验证TTC添加使用时结果检测的准确性，对菌落总数检测是否具有抑菌效果，采用中国检科院测试评价中心提供的能力验证标准菌进行对比试验，标准菌用0.85%生理盐水稀释后采用1∶10、1∶100、1∶1 000等梯度稀释，最后分别倾注不含TTC和含有0.001%TTC的PCA培养基进行试验，待样品凝固后倒置于细菌培养箱，（36±1）℃下培养24 h，对平板上菌落进行计数，并观察菌落形态。

2 结果与分析

2.1 TTC显色特征分析

未添加TTC的平板上菌落呈现白色至淡黄色，奶溶液中的菌落呈蔓延状态，无论是奶溶液还是生理盐水中，菌落颜色随着菌落计数琼脂中TTC的浓度增加，逐渐由淡红色变为深红色；随着添加浓度的增加，显色效果越明显，使菌落更易辨认，如图1、图2所示。

图1 菌落在奶粉中不同浓度TTC显色状态图

图2 菌落在生理盐水中不同浓度TTC显色状态图

2.2 TTC使用浓度分析

3个糕点样品和3个饼干样品菌落总数结果均显示，未添加TTC和添加0.000 1%TTC的检测结果偏低，而添加0.001 0%～0.002 0%TTC的检测结果明显偏高，如表1所示。

表1 不同样品添加不同浓度TTC检测结果对比表（单位：CFU·g-1）

通过平板对比得到，未添加TTC的菌落形态和样品料渣极为接近，计数时易漏读或误把料渣计为菌落，尤其饼干类样品菌落蔓延较大，影响计数的准确性。添加0.000 1%TTC的平板菌落亦呈白色，随着TTC添加浓度的增加，菌落由粉红色逐渐显色至深红色，和白色的产品料渣形成鲜明对比，较易区分，如图3所示；饼干类样品随着TTC添加浓度的增加，菌落蔓延现象逐渐减少，菌落呈现清晰的红色状态，极易区分和计数，如图4所示。

图3 糕点样品添加不同浓度TTC菌落形态对比图

图4 饼干样品添加不同浓度TTC菌落形态对比图

由不同TTC浓度检测结果可得，当添加浓度低于0.001 0%时菌落亦蔓延，菌落显色不佳，不便于计数，而当TTC浓度为0.001 0%～0.002 0%时菌落显色明显，便于计数，且对菌落的生长无明显抑制作用。

由TTC最佳使用浓度分析试验可得，不添加TTC时，菌落蔓延明显，菌落有重叠现象，检测结果明显低于添加TTC；而TTC的添加量为0.001%～0.003%时，检测结果较为稳定，但TTC添加量为0.004%～0.005%时，检测结果明显偏低，如图5所示。说明当TTC添加浓度≤0.003%时，对菌落总数检测无抑菌作用，当添加浓度≥0.004%时有明显的抑菌作用。

图5 不同浓度TTC下菌落总数检测结果图

2.3 TTC应用于不同类型产品菌落总数检测

如图6、图7所示，糕点产品或饼干产品稀释后均存在不同颗粒度的料渣或者油脂，培养后的菌落一般呈现白色或淡黄色，和部分料渣极为相似，菌落计数琼脂中未添加TTC时，不易区分料渣颗粒和菌落，导致计数结果偏低，而使用添加0.001%的TTC作为显色剂时，能明显区分红色菌落，使菌落计数准确度更高。对比添加与未添加显色剂的样品菌落总数来看，含有样品渣的固体检样添加TTC显色剂后，检测结果明显偏高，而未添加TTC的检测结果偏低。同时，用标准菌样本对含有0.001%TTC的显色能力进行验证，发现添加0.001%TTC对结果无明显抑制作用，如表2所示。

表2 不同样品不添加TTC和添加TTC检测结果对比表

图6 糕点样品未添加TTC和添加TTC对比图

图7 饼干产品未添加TTC和添加TTC对比图

3 结论与讨论

3.1 结论

对TTC的显色特性进行分析，TTC可以使活菌菌落呈现红色，且添加浓度越高，菌落红色越明显，且能有效抑制菌落蔓延。

使用不同浓度TTC检测糕点、饼干样品菌落总数时，由于菌落呈红色，与产品白色或淡黄色料渣对比鲜明，相比不含TTC的培养基，菌落计数更加方便，当TTC使用浓度＜0.001 0%时菌落偏小，且易蔓延，不便于计数，但使用浓度0.001 0%～0.002 0%时，菌落形态偏大，能有效减少蔓延菌落。故0.001 0%～0.002 0%的TTC添加量使用于固体样品的检测，能显著区分菌落和料渣，避免误读，提高菌落总数检测的准确性。

在固体样品，如糕点、膨化及饼干样品检测中，有明显料渣或油脂颗粒的菌落总数检测中，TTC的使用可以明显区分菌落和料渣。同时，在用标准菌进行对比试验得到，添加使用0.001%的TTC，对菌落总数检测无抑制作用，即在该浓度下菌落能够很好地显色，同时又不会对菌落总数产生显著性的差异；通过进一步使用浓度分析得到，TTC添加量≤0.003%时，对菌落总数的检测无影响。

3.2 应用与探讨

使用TTC时，明显看出在糕点产品检测时较少蔓延现象，而在饼干检测中较多蔓延菌落，因此TTC在糕点类产品和饼干类产品中的抑菌效果是否相同需要进一步分析。TTC应用于不同样品的检测，如水、环境涂抹检测、调味料等呈现的菌落形态均不同，在水中菌落生长慢，即使添加TTC，培养48 h菌落较小；而环境涂抹中部分菌落无法被TTC染色，故不同菌落在使用TTC显色时呈现不同状态，需要进一步分析研究。