王俊，李建刚，李亮

（新疆医科大学第二附属医院 普外科，新疆 乌鲁木齐 830028）

胆管癌是一种胆管上皮细胞来源的恶性肿瘤，具有恶性程度高、侵袭性强的特点。近年来胆管癌病死率呈现逐渐上升的趋势[1-3]。目前研究显示手术切除可提高胆管癌患者的生存率，手术后5 年生存率约为20%～40%[4-5]；但另一方面，较高的复发率及早期淋巴结转移仍制约着胆管癌的治疗。目前针对胆管癌的研究，不仅需要考虑癌细胞与肿瘤微环境复杂的调控关系，还需要积极寻找到可靠的效应分子以提高胆管癌早期筛查的生物标志物的敏感性和特异性[6-7]。

丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）在信号转导中具有重要作用，哺乳动物细胞中有四个主要的MAPK家族：ERK1/2、ERK5、JNK和p38 MAPK，其中p38 MAPK又由四个成员组成：p38α（MAPK14）、p38β（MAPK11）、p38γ（MAPK12）和p38δ（MAPK13）[8-9]。有研究表明，MAPK13能够影响胆管癌细胞的迁移和侵袭，这表明其在胆管癌中可能扮演重要角色[10-11]。我们前期预实验发现，MAPK13在胆管癌患者组织中表达升高，因此本研究试图扩大样本量进一步分析其在胆管癌组织和细胞中的表达情况，探讨MAPK13对细胞迁移和侵袭及上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）过程的影响，以期为未来靶向治疗和早期生物标志物的选择提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 临床组织标本

收集2018年1月至2019年12月新疆医科大学第二附属医院18例胆管癌患者的组织标本。所有标本均经病理检查证实为胆管癌。患者年龄44～77 岁；其中男10例，女8例。样本TNM分期：Ⅰ期2例，Ⅱ期6 例，Ⅲ期8 例，Ⅳ期2 例。所有胆管癌患者术前均未接受过放化疗或其他方式胆管癌治疗。手术切除的所有胆管癌组织及邻近组织标本立即液氮保存，-80 ℃冰箱长期保存。研究获我院伦理委员会批准（批准号：20171220）。

1.2 细胞培养

胆管癌细胞系RBE、LICCF、CCLP1、QBC939和人胆管上皮细胞HIBEC均购自北纳生物（北京）。RBE细胞用碳酸氢钠（1.5 g/L）、葡萄糖（2.5 g/L）、丙酮酸钠（0.11 g/L）在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养。HIBEC和QBC939 细胞用90% RPMI-1640和10% FBS培养。LICCF细胞在MEM-EBSS培养基中培养。CCLP1 细胞在含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中培养。所有细胞系均在37 ℃、5% CO2条件下培养。

1.3 微阵列分析筛选肿瘤组织差异表达mRNA

研究选取9 对胆管癌（包含6 例肝内胆管细胞癌，2 例远端胆管癌和1 例肝门部胆管癌）及其邻近组织，提取细胞总RNA，以T7 Oligo（dT）为引物，合成cDNA。以cDNA为模型，选择T7 Enzyme Mix合成cRNA，加入100 μmol/L生物素，通过磁珠纯化去除cRNA中的盐分和酶。通过添加来自Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array的组织形成杂交。cRNA片段化（100 bp）后，在45 ℃预杂交组织中进行杂交。用等量的杂交液代替预杂交液，用生物素标记在cRNA上，使其再次杂交，45 ℃、16 h。洗脱和染色处理后，通过安捷伦微阵列扫描仪获得数据。使用基因芯片操作软件1.0版进行分析，用R来构建火山图和Pheatmaps。标准为log2（差异倍数）＞2，-log10（校正P值）＞2，用于筛选差异表达的mRNA。

1.4 免疫组化分析

组织切片用二甲苯脱蜡，并用各种浓度的乙醇脱水。山羊血清在室温下孵育15 min后切片加入1滴1∶100稀释的一抗（MAPK13 Antibody，1∶200，BA2847，武汉博士德），4 ℃冰箱孵育过夜。加入辣根酶标二抗（Rabbit anti-Avidin-HRP，1∶3 000，BA1082，武汉博士德），4 ℃冰箱保存30～40 min。用1滴新鲜制备的DAB溶液显色20 min。细胞核用苏木精复染30 s，逐步增加乙醇浓度脱水，并用二甲苯透明、中性树脂封固进行显微镜观察。

1.5 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析

通过TRIzol试剂（Invitrogen Life Technologies，美国）从各组细胞中提取总RNA。经NanoDrop 2000（Thermo Fisher Scientific Inc，美国）定量后，用200 ng总RNA，按照说明书使用ReverTra Ace QRT-PCR Kit（日本）进行逆转录操作。将结果处理至THUNDERBIRD SYBR® qPCR Mix（日本），进行qRT-PCR分析。根据各参照组中GAPDH的含量，每组重复进行3次。mRNA采用相对定量法计算。引物序列信息见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.6 蛋白印迹分析

取各处理组100 μg用SDS-PAGE电泳，转移至PVDF膜，200 mA恒流120 min。室温下将膜浸入含5%脱脂奶粉的TBST中1 h；加入一抗工作液（抗MAPK13，1∶1 000；抗E-cadherin，1∶500；抗N-cadherin，1∶1 000；抗波形蛋白，1 μg/mL；抗GAPDH，1∶10 000，Abcam，美国），4 ℃过夜。组织用TBST洗涤3次，加入二抗（ab7090，1∶2 000，Abcam，美国），室温孵育1.5 h。用ECL Plus（Life Technology，上海）对膜进行着色。GAPDH蛋白条带作为内参。

1.7 细胞转染

采用双酶切法克隆人MAPK13转录本1ORF克隆载体，PCR法克隆5’端EcoRI限制性内切酶位点和3’端含有BamH1序列的MAPK13片段。采用BamH1双酶切法获得载体序列，将PCR产物与消化产物连接。之后提取大量质粒pcDNA3.1-MAPK13，并将提取物保存在-20 ℃。由吉马公司设计MAPK13 siRNA序列并合成siRNA。si-MAPK13、pcDNA3.1-MAPK13质粒载体和pcDNA3.1 质粒载体均购自吉马公司。根据说明书用Lipofectamine 2000（Life Technologies，美国）进行转染，并在37 ℃、5% CO2中孵育48 h。本研究设置如下分组：转染si-MAPK13组（si-MAPK13组），转染pcDNA3.1-MAPK13组（MAPK13组），仅转染pcDNA3.1质粒载体（NC组），未对胆管癌细胞进行任何处理组（Blank组）。

1.8 细胞增殖能力分析

采用CCK-8 试剂盒（上海生物科技有限公司），按照说明书进行操作。实验重复3次。

1.9 Transwell细胞迁移和侵袭实验

迁移：用胰蛋白酶消化细胞，PBS洗涤2次并重悬于1%胎牛血清培养基中。将细胞密度调整为5×105/mL，在Transwell室中加入100 μL细胞悬液。常规培养24 h后，取出Transwell小室，PBS洗2次，甲醇固定30 min，适当风干腔室。0.1%结晶紫染色腔室20 min，用湿棉签擦拭非迁移的上层细胞，PBS洗涤小室3次，显微镜下观察细胞并拍照。

侵袭：用无血清培养基稀释基质胶，在每个腔室中加入50 μL基质胶，培养箱中培养直至基质胶凝固。2 h后加入200 μL无血清培养基水化Matrigel，保存于培养箱中。经胰蛋白酶消化获得细胞悬液。上室加入200 μL细胞悬液（含5×103个细胞），下室加入500 μL含10% FBS的细胞悬液。培养24 h后取出细胞，用PBS洗涤2次，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%结晶紫染色30 min。用PBS清洗小室2次，并在显微镜下拍照。

1.10 裸鼠成瘤实验

20只BALB/c裸鼠，4～6周龄，购自北京维通利华公司。动物随机分为4组（每组5只）。按照1.7实验分组分别接种0.2 mL（约1×107个细胞）到小鼠右侧腋窝。观察小鼠生命和肿瘤生长情况。4周后所有小鼠均存活并通过颈椎脱位处死。测量肿瘤大小、重量。

1.11 统计学分析

使用Graph Pad Prism 6.0软件进行统计学分析。研究中符合正态分布的数据采用（±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单向方差分析或双向方差分析，事后两两比较采用Tukey检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 MAPK13在胆管癌组织中的表达情况

微阵列mRNA差异表达分析显示，MAPK13 在胆管癌中显著高表达（图1A、1B，P＜0.05）。免疫组化分析显示，MAPK13蛋白在胆管癌组织中的表达量（4.30±0.81）明显高于癌旁组织（1.09±0.10）（图1C，t=6.90，P＜0.01）。qRT-PCR检测显示，MAPK13在胆管癌组织中的mRNA表达量（3.30±0.10）明显高于癌旁组织（1.02±0.11）（图1D，t=27.92，P＜0.01）。进一步的蛋白印迹检测显示，MAPK13在胆管癌组织中的蛋白表达水平也明显高于癌旁组织（图1E、1F）。以上结果均表明MAPK13在胆管癌组织中高表达。

图1 MAPK13在胆管癌组织和癌旁组织中的表达情况

2.2 MAPK13对胆管癌细胞增殖和凋亡的影响

为了了解MAPK13在胆管癌细胞生长中的作用，研究首先分析MAPK13在胆管癌细胞中的表达情况。MAPK13 mRNA在胆管癌细胞系RBE（3.41±0.49）、LICCF（2.76±0.30）、CCLP1（1.85±0.20）、QBC939（2.10±0.30）以及正常胆管细胞系HIBEC（1.00±0.01）中均有表达，其中以RBE细胞系中的表达最为显著（图2A1，F=26.51，P＜0.01）。因此，本研究选择RBE细胞系进一步观察MAPK13在胆管癌中的作用。

图2 MAPK13对肿瘤细胞增殖及凋亡的影响

转染MAPK13 siRNA构建基因干扰模型，转染pcDNA3.1-MAPK13 构建MAPK13 过表达模型，通过qRT-PCR和蛋白印迹分别验证MAPK mRNA（图2B1，F=105.5，P＜0.05）和蛋白表达水平，模型构建成功。

利用CCK-8 实验观察细胞的增殖情况，si-MAPK13 转染组OD值明显低于NC组，转染外源pcDNA3.1-MAPK13基因后，MAPK13转染组OD值明显高于空白对照组（图2C，F=32.13，P＜0.01）。细胞凋亡结果显示，当MAPK13 被抑制时，细胞凋亡率增加（16.80±3.13），反之亦然（图2D，F=34.05，P＜0.01）。以上结果均表明MAPK13的过表达会促进胆管癌细胞增殖并抑制细胞凋亡。

2.3 MAPK13 对细胞迁移和侵袭及上皮间质转化（EMT）进程的影响

研究结果显示，MAPK13 被抑制后，细胞迁移（97.34±8.12）和侵袭（41.50±3.00）的数量显著减少；而当MAPK13过表达，细胞迁移（284.50±25.24）和侵袭（145.45±15.24）的数量显著增加（迁移见图3A、侵袭见图3B，F值分别为52.88和38.14，均P＜0.05）。

图3 MAPK13对细胞迁移和侵袭及上皮间质转化（EMT）进程的影响

敲除MAPK13 后，胆管癌细胞中对MAPK13起抑制作用的E钙黏蛋白（E-cadherin）表达更高（2.23±0.12），而N钙黏蛋白（N-cadherin）（0.48±0.04）和波形蛋白（Vimentin）（0.62±0.05）表达更低（F值分别为77.00、78.73、25.9；均P＜0.01）；而当MAPK13 过表达时，细胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表达情况与前述相反，这表明MAPK13促进了EMT进程（图3C，P＜0.05）。

2.4 MAPK13在体内成瘤中的作用

体内成瘤实验显示，抑制MAPK13的表达后肿瘤体积和肿瘤重量明显低于Blank组和NC组；而当MAPK13 过表达时肿瘤体积和肿瘤重量均较NC组增加（图4A、4B，F值分别为8.99、73.81；均P＜0.01）。进一步的组织病理和Ki-67 免疫组化分析验证了这一过程（图4C、4D）。

图4 MAPK13在裸鼠体内成瘤的作用

通过检测MAPK13 在肿瘤中 mRNA 和蛋白质的表达验证了si-MAPK13 和MAPK13 处理组对MAPK13 表达的调控作用（图4E，P＜0.01）。通过检测EMT相关蛋白发现，抑制MAPK13表达后，Ecadherin的表达增加，但N-cadherin和Vimentin的表达减少，这表明MAPK13 低表达抑制了EMT进程；而MAPK13的过表达会导致E-cadherin的表达降低，N-cadherin和Vimentin的表达增加，表明过表达MAPK13能够促进EMT进程（图4F，P＜0.05）。

3 讨论

胆管癌是消化道恶性程度很高的肿瘤之一，尽管临床多种治疗手段，如手术、放化疗的应用在一定程度上改善了患者预后，但出现转移的患者预后仍不佳，因此探索胆囊癌转移的机制迫在眉睫[12-13]。MAPK13 信号通路在调控肿瘤细胞周期及凋亡相中发挥重要作用[14-15]。有研究显示MAPK13基因敲除能够抑制结肠炎诱发的结肠癌[16]，另有研究显示在黑色素瘤细胞中MAPK13 的过表达能够抑制肿瘤细胞增殖[17]。这些结果表明MAPK13在肿瘤发生发展中起着重要作用，但MAPK13与胆囊癌的关系尚不清楚。本次研究通过微阵列等一系列实验发现MAPK13在胆囊癌组织、正常胆囊组织中差异表达，提示MAPK13可能与胆囊癌有关。随后的体内体外实验均表明MAPK13过表达能够显著促进胆囊癌的恶性行为。这些结果提示，MAPK13参与了胆囊癌的发生发展[18]。

上皮间质转化（EMT）指上皮细胞发生形态转变，变为间质细胞的一个过程，是恶性肿瘤侵袭和转移的关键环节[19]。肿瘤在侵袭、转移过程中伴随着EMT的发生，因此抑制肿瘤EMT可能是一种治疗方法。多种基因或非编码RNA可通过调控胆囊癌EMT发挥作用，如SIRT3 可抑制胆囊癌细胞EMT，从而发挥其抑制功能[20]；另外miR-182 可靶向促进EMT进而促进胆囊癌侵袭、转移[21]。EMT在胆囊癌发生、进展中至关重要，那么MAPK13是否也与EMT发生有关？基于此，本研究进行了探索：体内、体外结果均发现，MAPK13过表达激活了肿瘤细胞EMT过程；反之，MAPK13 低表达抑制了肿瘤细胞EMT过程；这提示MAPK13 可能是通过调控肿瘤EMT过程发挥其生物学功能。

但本次研究存在一定的局限性，虽然我们检测了肿瘤组织中MAPK13的表达，但其与胆囊癌临床病理特征、预后的关系尚需要进一步分析；另外，对于MAPK13调控胆囊癌细胞的具体机制以及下游通路有待进一步研究探索。