葛 欣

中国人民解放军北部战区总医院肝胆外科，辽宁沈阳 110016

根治性手术是目前国内外所公认的治疗胆囊癌最有效手段，然而因该病早期具有极强的隐匿性，导致绝大部分一经确诊便已是中晚期，丧失了手术根治的最佳时机，预后普遍不良。因此，如何有效早期诊断胆囊癌对改善患者预后具有极其重要的意义。MiRNA是近年来所发现的一类长度在21～25 个核苷酸的小分子RNA，可通过调控靶基因的表达，参与多种疾病的发生、发展过程[1-3]。且有研究报道证实[4-6]，miRNA-187 在乳腺癌以及宫颈癌等肿瘤细胞中存在异常表达；miRNA-143 在胃癌以及膀胱癌中存在异常低表达。然而，关于上述两种miRNA 在胆囊癌中的表达研究并不多见[7-8]。鉴于此，本文通过研究血清miRNA-187、miRNA-143 和胆囊癌病理特征的关系及二者诊断胆囊癌的价值并予以分析，以期为胆囊癌的诊断提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2013年9月至2021年3月北部战区总医院收治的92 例胆囊癌患者为胆囊癌组，另取同期收治的80 例胆囊良性疾病患者作为胆囊良性疾病组，再选取同期健康体检者80 例作为健康对照组。胆囊癌组中，男32 例，女60 例；年龄34～79 岁，平均（62.62±10.34）岁；TNM 分期：Ⅰ～Ⅱ期31 例，Ⅲ～Ⅳ期61 例；分化程度：低分化23 例，中高分化69 例；淋巴结转移41 例，无淋巴结转移51 例。胆囊良性疾病组中，男28 例，女52 例；年龄32～79 岁，平均（62.71±10.31）岁；疾病类型：胆结石32 例，胆囊腺肌症11例，胆囊炎30 例，胆囊穿孔7 例。健康对照组中，男27例，女53 例；年龄31～82 岁，平均（62.66±10.25）岁。三组研究对象的一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。纳入标准：①所有入组人员均经手术病理检查确诊；②均为成年人；③入组前均未接受任何抗肿瘤治疗；④临床病历资料完整。排除标准：①合并其他恶性肿瘤者；②心、肝、肺等脏器发生严重病变者；③伴有严重感染性疾病或（和）全身免疫系统疾病者。所有患者及其家属均对本研究知情同意，并签署知情同意书；本研究经医院医学伦理委员会审核批准。

1.2 方法

1.2.1 标本获取 分别获取所有人员的晨起空腹静脉血5 ml，于室温条件下静置0.5 h，取上清液进行离心处理，转速820 r/min，半径12 cm，离心10 min。获取上层血清置于离心管内，于常温条件下实施16 000 r/min 离心，离心半径8 cm，离心10 min，取上层血清保存至-80℃冰箱中待检。

1.2.2 血清miRNA-187及miRNA-143 水平检测检测方式为实时定量PCR，首先按照微RNANeasy 提取试剂盒说明书完成微RNA 的提取，借助紫外分光度将吸光度比值处于1.8～2.0 的标本用作上述血清学指标的检测。遵循微RNA 反转录试剂盒说明书逆转录获取cDNA。按照GenBank 中的miRNA-187、miRNA-143 以及U6 序列号，采用Premier Primer 5.0 软件完成引物的设计，由苏州金唯智生物科技有限公司负责引物合成。其中miRNA-187 引物序列如下：正向引物5′-TCGTGTCTTGTGTTGCAGC-3′，反向引物：5′-GTCAGGGTCCGAGGT-3′。miRNA-143 引物序列如下： 正向引物5′-ATGCCCTTTCATCATTGC-3′，反向引物：5′-GAGCTACAGTGCTTC-3′。U6 引物序列如下：正向引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物：5′-AACGCTTCGAATTTGCGT-3′。实时定量PCR 总反应体系25 μl，涵盖上下游引物各1.0 μl，cDNA 0.8 μl，RNaseH2O 为12.2 μl，SYBRPPrimix Ex TaqTM10 ml。反应条件如下：预变性95℃10 min，变性95℃5 s，退火60℃60 s，延伸55℃60 s，共40 个循环。以2-△△Ct表示相对表达量。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验；绘制ROC 曲线分析血清miRNA-187及miRNA-143 水平诊断胆囊癌的效能。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组血清miRNA-187及miRNA-143 水平的比较

胆囊癌组血清miRNA-187 高于胆囊良性疾病组及健康对照组，而miRNA-143 低于胆囊良性疾病组及健康对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；胆囊良性疾病组血清miRNA-187 高于健康对照组，而miRNA-143 低于健康对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

表1 三组血清miRNA-187及miRNA-143 水平的比较（±s）

表1 三组血清miRNA-187及miRNA-143 水平的比较（±s）

注 与胆囊良性疾病组比较，aP＜0.05；与健康对照组比较，bP＜0.05

组别例数miRNA-187miRNA-143胆囊癌组胆囊良性疾病组健康对照组F 值P 值92 80 80 6.61±1.32ab 3.20±1.01b 1.02±0.31a 42.593＜0.001 0.48±0.13ab 1.33±0.32b 2.25±0.47a 56.739＜0.001

2.2 不同临床特征胆囊癌患者血清miRNA-187 水平的表达情况

TNM 分期为Ⅲ～Ⅳ期、低分化及淋巴结转移胆囊癌患者的血清miRNA-187 表达水平均高于TNM 分期为Ⅰ～Ⅱ期、中高分化及无淋巴结转移胆囊癌患者，差异有统计学意义（P＜0.05）（表2）。

表2 不同临床特征胆囊癌患者血清miRNA-187 水平的表达情况（±s）

表2 不同临床特征胆囊癌患者血清miRNA-187 水平的表达情况（±s）

临床特征例数miRNA-187t 值P 值性别0.419 0.676男女32 60 6.69±1.36 6.57±1.28年龄（岁）＜60≥60 TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期Ⅲ～Ⅳ期分化程度低分化中高分化淋巴结转移0.930 0.355 39 53 6.46±1.26 6.72±1.37 6.643＜0.001 31 61 5.30±1.18 7.26±1.41 5.608＜0.001 23 69 7.87±1.45 6.19±1.17 7.454＜0.001有无41 51 7.74±1.37 5.70±1.25

2.3 不同临床特征胆囊癌患者血清miRNA-143 水平的表达情况

TNM 分期为Ⅲ～Ⅳ期、低分化及淋巴结转移胆囊癌患者的血清miRNA-143 表达水平均低于TNM 分期为Ⅰ～Ⅱ期、中高分化及无淋巴结转移胆囊癌患者，差异有统计学意义（P＜0.05）（表3）。

表3 不同临床特征胆囊癌患者血清miRNA-143 水平的表达情况（±s）

表3 不同临床特征胆囊癌患者血清miRNA-143 水平的表达情况（±s）

临床特征例数miRNA-143t 值P 值性别1.109 0.270男女32 60 0.50±0.13 0.47±0.12年龄（岁）＜60≥60 TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期Ⅲ～Ⅳ期分化程度低分化中高分化淋巴结转移0.829 0.409 39 53 0.49±0.12 0.47±0.11 10.931＜0.001 31 61 0.70±0.20 0.37±0.09 7.879＜0.001 23 69 0.30±0.07 0.54±0.14 8.632＜0.001有无41 51 0.33±0.12 0.59±0.16

2.4 血清miRNA-187及miRNA-143 诊断胆囊癌的效能

分析ROC 曲线发现，血清miRNA-187 联合miR-NA-143 诊断胆囊癌的AUC、灵敏度、特异度及约登指数均高于上述两项指标单独诊断（表4、图1）。

表4 血清miRNA-187及miRNA-143 诊断胆囊癌效能的ROC 曲线分析

图1 血清miRNA-187及miRNA-143 诊断胆囊癌效能的ROC 曲线

3 讨论

MiRNA-187 以及miRNA-143 均是miRNA 家族重要成员之一，是近年来所发现的两种新型miRNA，且和多种恶性肿瘤的发生、发展以及侵袭密切相关，甚至具有成为多种恶性肿瘤预后评估的潜在标志物[9-11]。

本研究结果显示，胆囊癌组血清miRNA-187 水平高于胆囊良性疾病组，而miRNA-143 水平低于胆囊良性疾病组（P＜0.05）。这在徐顺林等[12]的研究报道中得以佐证，提示了血清miRNA-187 在胆囊癌中异常高表达，而miRNA-143 异常低表达，两者均可能在胆囊癌的发生、发展过程中起着至关重要的作用。考虑原因，miRNA-187 的过表达可促进多种促癌基因的过度表达以及抑制抑癌基因的表达，进一步促进了肿瘤细胞的增值、转移以及侵袭。miRNA-143 可发挥调节增殖、凋亡相关蛋白的作用，从而起到抑制肿瘤增殖、分化的作用，在胆囊癌中扮演着抑癌基因的角色。此外，血清miRNA-187 联合miRNA-143 诊断胆囊癌的AUC、灵敏度、特异度以及约登指数均高于上述两项指标单独诊断。这提示了在临床实际工作中，可能通过联合检测上述两项血清学指标水平，继而达到早期辅助诊断胆囊癌的目的。究其原因，联合检测具有一定的协同作用，从抑癌基因以及促癌基因两个方面为胆囊癌的诊断提供参考依据。另外，本研究结果显示血清miRNA-187 与miRNA-143 的表达和胆囊癌患者TNM 分期、分化程度以及淋巴结转移密切相关，可能即随着miRNA-187 水平的升高以及miRNA-143 水平的降低，胆囊癌患者TNM 分期越晚，分化程度越低，淋巴结转移风险越大。这在既往相关研究报道中均得到类似发现[13]：结肠癌转染miRNA-187之后，其增殖活性显著升高，且迁移能力显著增强，凋亡细胞的比例存在一定程度的降低。miRNA-143 主要定位于染色体5q32 位点，于恶性肿瘤的增殖、迁移以及药物抵抗等方面具有极其重要的作用。另有研究报道显示，胆囊癌在转染miRNA-143 之后，胆囊癌细胞的增殖以及迁移能力均得到显著的抑制，而在转染miRNA-143 抑制剂之后，胆囊癌的细胞增殖活性增强，迁移能力亦显著提高，证实了miRNA-143 和胆囊癌的增殖、迁移关系密切[14-15]。

综上所述，胆囊癌患者血清miRNA-187 存在异常高表达，而miRNA-143 存在异常低表达，联合检测可能有助于胆囊癌的临床诊断以及病情评估。