郑小蔚 黄小兰 陈小青

1.福建医科大学附属第二医院检验科，福建泉州 362000；2.福建医科大学附属第二医院生殖医学科，福建泉州 362000；3.福建医科大学附属第二医院免疫内科，福建泉州 362000

迄今为止，经过多年的研究，复发性流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）仍然是医学的一个挑战。传统通常将3 次或3 次以上在孕28 周前的流产称为RSA[1]，但大部分研究认为，若连续发生2 次及以上的流产，再次出现流产的风险也随之提高，应加强重视。流行病学调查研究发现，RSA 的发病率为1%～3%，约影响3%的孕妇，且早期约占全部RSA 的80%[1-2]。一项前瞻性研究结果显示，RSA 复发风险随着流产次数增加而上升，既往的自然流产史是一个独立危险因素，每次流产的风险增加约11%，在3 次或3 次以上的流产后约占40%[3]。各种病因，无论是单独的还是联合的，都被认为是导致流产的原因，包括子宫畸形、感染、母体血栓性疾病、免疫功能障碍、各种内分泌紊乱和父母染色体异常[4]。在各种病因中，遗传因素似乎与生殖损失高度相关[5-6]。在50%的夫妇中，没有明确的病因，在这种情况下，他们被认为患有特发性或无法解释的RSA[6]。在29%～60%的病例中，RSA 可由胚胎的染色体畸变引起[7]。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年1月至2021年10月在福建医科大学附属第二医院妇产科收治的420 对RSA 患者夫妇作为研究对象。年龄：男性23～53 岁，平均（33.23±4.68）岁，女性23～45 岁；平均（32.51±3.89）岁；超声评估胎停孕龄为7～15 周，纳入标准：①同一对夫妇连续发生2 次或者2 次以上流产；②妊娠28 周之前的流产；③表型和智力均正常；④非近亲婚配。排除标准：病毒感染及器质性病变等因素导致的生殖异常。本研究取得参与研究者的知情同意，并获得福建医科大学附属第二医院伦理委员会的批准。

1.2 方法

1.2.1 外周血染色体制备 1 ml 外周血加入5 ml 的人外周血淋巴细胞培养基培养液（广州达晖生物公司，批号：X10Y210512）中，于培养箱（Thermo3110 型）内培养72 h，加入浓度为100 μg/ml 的秋水仙素（杭州宝荣，批号：J190801）50 μl 继续培养22 min，收获染色体，常规染色体制片，行G 显带核型分析。外周血染色体核型分析：一般情况下每份标本随机计数20个分裂相，记录所见的任何的数目和结构畸变，选择3～5 个分裂相进行核型分析。如果是嵌合体病例，则每一细胞系至少分析1 个细胞，特殊病例应加大分析的细胞数目至50～100 个。

1.2.2 胚胎流产物染色体制备 ①采集所有行清宫手术的早期自然流产孕妇的绒毛组织10 g 并将其置于含有1640 培养液（杭州宝荣，批号：C1210701）的瓶子中。②在倒置显微镜（OLYMPUS，型号：IX53P1F）下挑选收集到的患者绒毛组织，选择约5 g 左右分支明显的绒毛。③利用1640 培养液对绒毛组织进行漂洗后将其剪碎，保证整个过程在无菌条件下进行。④将准备好的绒毛组织置于含2 ml，250 U/L 胶原酶Ⅱ（CAS：9001-12-1）的离心管内并放置于含有5%CO2的培养箱（Thermo3110 型）内静置10 min。⑤开盖后置于40℃培养箱内保存，第二天可根据细胞培养的方法培养采集的绒毛细胞并制备染色体。胚胎流产物染色体核型分析：一般情况下每份标本随机计数20 个分裂相，记录所见的任何的数目和结构畸变，选择3～5个分裂相进行核型分析。如果是嵌合体病例，则每一细胞系至少分析1 个细胞，特殊病例应加大分析的细胞数目至50～100 个。

1.2.3 胚胎流产物组织低深度全基因组测序 试剂采用华大生物科技（武汉）有限公司的染色体非整倍体检测试剂盒（联合探针锚定聚合测序法），仪器采用深圳华大基因生物医学工程有限公司的基因测序仪（BGISEQ-500）。①流产物组织样品准备及DNA 提取；②文库构建打断；③聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）；④Poolin 构建好文库经Agilent2100 Bioanalyzer 及实时定量，基因扩增荧光检测系统（real-time polymerase chain reaction，QPCR）检测合格后，将一定量的文库按照等物质的量混合，上机测序（BGISEQ-500）后进行信息分析。

1.3 观察指标及评价标准

观察RSA 孕妇外周血结果、胚胎染色体结果、胚胎染色体低深度全基因组测序（copy number variation sequencing，CNV-seq）结果，分析孕妇年龄、流产次数与染色体异常的关系。采用染色体G 显带进行外周血染色体核型分析、胚胎染色体核型分析，核型描述遵循《人类细胞遗传学国际命名体制》（ISCN2016）[8]。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0 统计学软件进行数据分析。采用Kolmogorov-Smirnov 检验是否符合正态分布。所有计量资料进行正态性检验，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，计数资料用率表示。高通量数据分析：数据分析软件采用染色体非整倍体分析软件来自华大生物科技（武汉）有限公司。

2 结果

2.1 RSA 孕妇外周血结果的分析

420 对RSA 孕妇外周血染色体有42 对异常核型，阳性率10%，其中染色体平衡易位20 对，占47.6%，罗伯逊易位3 对，占7.1%，染色体多态性15 对，占35.7%，性染色体异常2 对，占4.8%，染色体嵌合2对，占4.8%。

2.2 胚胎染色体结果的分析

420 对RSA 胚胎组织染色体，成功383 对，有113 对异常核型，阳性率29.5%，其中染色体平衡易位10 对，占2.6%，罗伯逊易位8 对，占2.1%，染色体多态性15 对，占3.9%，性染色体异常20 对，占5.2%，染色体嵌合13 对，占3.4%，三体35 对，占9.1%，结果正常270 对，占70.5% 。

2.3 胚胎染色体CNV-seq 结果的分析

420 对胚胎染色体检出异常结果362 对，占86.2%，阴性结果58 对，占13.8%，非整倍体中，单体以45，X 最多，三体以16 三体最多（表1）。

表1 420 例胚胎染色体结果分析

2.4 孕妇年龄、流产次数与染色体异常的关系

420 对RSA 孕妇根据年龄分3 个亚组，年龄≥40岁组染色体异常核型发生率34.2%，占比最高；年龄20～<30 岁组的染色体异常核型发生率最低。根据流产次数，流产3 次的异常核型占比最高，为37.8%，其次是流产3 次以上（表2）。

表2 年龄、流产次数与染色体异常的关系

3 讨论

夫妇外周血和/或胚胎染色体异常是引起早期RSA 的常见病因。国外有学者在长达20年的研究期间（1996-2016年），对627 对RSA 患者夫妇进行细胞遗传学分析，检测出69 对（11.00%）夫妇存在染色体异常[9]。临床上常见的有染色体易位，主要是相互易位（61%）和罗伯逊易位（16%）、基因多态性、臂内倒位、臂间倒位及性染色体异常，此外还有插入、缺失等[10]。本研究对420 对RSA 患者夫妇行外周血染色体检测，有42 例异常核型，阳性率10%，与国外的研究结果相符[11]。在3%～6%的RSA 夫妇中，一方有基因平衡的染色体结构重排。这种平衡易位占核型异常的最大比例[12]。这种异常配子的临床后果包括反复流产、死产、出生畸形儿童和智力残疾儿童[13]。如果夫妇任何一方是同源罗伯逊易位携带者，胚胎染色体可能出现单体或者三倍体，那么胚胎可能早期自然流产；如果夫妇为非同源罗伯逊易位携带者，胚胎染色体可能出现重复或缺失，大约2/3 的子代可能出现流产或畸形。如果妻子携带缺陷X 染色体，可能因偏斜X染色体的不对称失活及低频率X 单体嵌合体的异常高发率导致RSA[14-15]。在人类染色体中，9 号染色体为出现较高频率的多态性，一般情况下，个体间出现1%～2%的变异遵循孟德尔遗传定律[16]。Ueharas 等[17]报道，inv（9）与有不孕症和多次流产有关。男性患者随着年龄的上升，精子染色体异常也随之增高，特别是非整倍体，有研究者对精子进行核型分析，结果显示，在RSA 患者中，男方精子的非整倍体率显著增加[18]。近年来，国外有研究显示中国男性携带复杂染色体重排者（complex chromosomal rearrangement，CCR）也会引起RSA 的增加[19]。对CCR 累及的染色体及断裂点分析发现，累及6 号、7 号、8 号、11 号和16 号染色体的CCR 多会出现不良妊娠结局，断裂点出现在2q31、5q35 和8ql3 时RSA 多见。有报道称Y 染色体微缺失与RSA 并无相关性[20]。

研究显示，在RSA 中胚胎染色体异常发生率较夫妇染色体异常高，胚胎染色体出现非整倍体是最常见的流产因素，尤其是在妊娠早期[21]。国外有一项前瞻性研究显示，随着女性年龄的上升，卵母细胞非整倍体和多倍体的发生率升高，尤其是高龄女性（>35岁），RSA 的发生率也明显增加[22]。本研究结果显示，胚胎染色体非整倍体异常的患者年龄也以高龄（>35 岁）居多。Yang 等[23]对182 例妊娠患者均进行G 显带细胞遗传学分析和新型高通量连接依赖探针扩增（high-throughput ligation-dependent probe amplifica tion，HLPA）技术，以检测染色体异常。对74 例患者进行低覆盖全基因组测序（whole-genome sequencing，WGS），检测拷贝数变异（copy number variations，CNVs）。WGS 提示RSA 组致病性CNVs 发生率高于对照组。在自然流产患者中，核型异常和致病性CNVs的发生率较高。周静等[24]共发现1040 例异常核型，发生率为44.86%（1040/2318），占异常核型的73.24%（1040/1420），是胚胎早期停止发育的重要原因，以16三体发生频率最高，其次是22 三体、45X 及多重非整倍体。本研究结果显示，420 对胚胎染色体异常中以X 号染色体发生频率最高，其次是16 染色体为多见，21 号染色体及22 号染色体最常见三体异常，CNV-seq共检出有致病意义的有109 对，包含了一些临床意义明确的基因组，dup（9）（p24.3p11.1）区域约47.31 Mb的重复与小耳畸形，生长迟缓有关[25]，del（3）（q11.1q11.2）与常染色体显性蛋白S 缺乏性血栓形成倾向有关[26]，dup（13）（q11q21.33）主要临床表现为身材矮小、智力低下、主动脉缩窄、面部畸形、共济失调、轻度痉挛步态和大头畸形等[27]。del（1）（p36.21p36.33）有相关综合征“chromosome 1p36 deletion syndrome”的报道[28]。

RSA 的患病率逐年增高，胚胎染色体异常是导致流产的主要原因，而染色体非整倍体数目异常最为常见，本研究建议，临床诊疗实际工作中，应重视遗传学病因的筛检，G 显带染色体核型分析培养作为流产查因的临床常规检测，但由于其培养过程比较繁琐，且分辨率>5 M，应用受到一定的限制，CNV-seq 近几年飞速发展，将CNV-seq 应用于临床流产查因，对于不明原因的RSA 者，明确流产的遗传学检测有助于探求可能的遗传学因素和父母双方遗传学异常的线索，为再次妊娠提供有针对性的孕前优生措施，还可为再次妊娠进行胚胎植入前诊断或产前诊断提供遗传学依据。随着辅助生殖技术发展，胚胎染色体异常导致的RSA 或可通过一些新技术手段进行干预，如胚胎植入前遗传学诊断技术[29]等来降低RSA 发生的概率。为临床精准诊疗提供了新的思路和方法，为深入了解RSA 遗传学病因及开展大规模临床实际应用提供科学依据。

综上所述，染色体检测可实现RSA 的准确诊断从而用于预防。本研究选用染色体细胞培养G 显带分析技术和CNV-seq 对绒毛细胞进行染色体检查，结合夫妇双方染色体分析进行综合评估，明确RSA的病因，为临床提供合适的指导，指导患者安全备孕避免RSA 的再发生。