洪秋语 伍亚男▲ 招浩熙 万信良

1.贵州中医药大学针灸推拿学院，贵州贵阳 550002；2.贵州中医药大学第二临床医学院，贵州贵阳 550002

冠状动脉粥样硬化性心脏病是目前导致患者残疾和死亡的重要原因之一[1]。恢复冠脉灌注是其治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病的基本原则，其中最主要的治疗手段是溶栓再通和经皮冠状动脉介入治疗[2]。然而研究显示，这些再灌注治疗手段可能会进一步导致心肌细胞损伤和功能障碍，这一病理过程称为心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）[3]。MIRI 的发生发展涉及氧化应激，炎症反应和钙超载等[4-5]。由于MIRI 的病理机制复杂，且尚无有效的治疗方案。因此，针对MIRI 的发病机制进行探索和预防治疗具有重要意义。

在中医理论中，MIRI 可归属于“胸痹”“心痛”等范畴，其病机多以瘀血内阻、心气不足为关键，故针对MIRI 宜采用活血散瘀、补益心气之法[6]。桃仁红花煎出自《陈素庵妇科补解》卷一，由桃仁、红花、丹参、香附、延胡索、乳香、青皮、赤芍、川芎、当归以及生地黄11 味中药材组成，该方具有理血行气、化瘀止痛之效，主治心脉痹阻证[7-9]。在现代医学研究及实践中，桃仁红花煎针对缺血所致的心肌损害疾病可发挥良好的治疗效果[7-9]。因此，本研究基于网络药理学与分子对接技术，预测并分析桃仁红花煎的成分、靶点及信号通路，进一步探讨治疗MIRI 的新思路。

1 资料与方法

1.1 桃仁红花煎的活性成分及其靶点的筛选

利用中药系统药理学数据库与分析平台（pharmacology database and analysis platform of traditional Chinese medicine system，TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php），以口服生物利用度≥30%、类药性≥0.18为筛选条件，检索出桃仁、红花、丹参、香附、延胡索、乳香、青皮、赤芍、川芎、当归的活性成分和靶点；并通过中药分子机制的生物信息学分析工具（bioinformatics tool for molecular mechanism analysis of traditional Chinese medicine，BATMAN -TCM，http://lib.cpu.edu.cn/92/7a/c1175a103034/page.htm），以阈值>55、P<0.05为筛选标准，获得生地黄的活性成分和靶点。

同时，通过中国知网、万方、中国生物医学文献数据库和维普数据库，对桃仁红花煎药物进行检索，将其中对MIRI 有明确治疗作用的化合物补充纳入为活性成分。利用UniProt 数据库，对已筛选的靶点进行统一化处理，从而转换为相应的基因名称。

1.2 MIRI 靶点收集

在DisGeNET 数据库、OMIM 数据库中，以“myocardial reperfusion injury”和“myocardial ischemia reperfusion injury”为检索词，筛选出并获取MIRI 疾病靶点。

1.3 交集靶点汇总及韦恩图制作

通过桃仁红花煎的潜在治疗靶点与MIRI 疾病靶点进行交集汇总，得出共同靶点。1

.4 桃仁红花煎的活性成分及靶点的网络构建

对桃仁红花煎的药物和靶点用编号进行统一处理：药物采用大写首字母为编号，如丹参”的编号为“DS”；唯一成分采用药物大写首字母加数字的形式为编号，如YHS1 等；共有成分则以A1 等作为编号。

将整理的数据导入至Cytoscape 3.8.2 软件，绘制出桃仁红花煎“活性成分-靶点”网络。

1.5 蛋白互作网络图的构建

将共同靶点导入STRING 数据库，进行蛋白互作网络的拓扑分析，使用Cytoscape 3.8.2 软件对结果进行可视化处理，制作蛋白互作网络图（protein-protein interaction networks，PPI）。

1.6 基因本体分析和京都基因与基因组百科全书分析

通过DAVID 数据库对桃仁红花煎治疗MIRI 的靶点进行基因本体（gene ontology，GO）分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG），物种设定为“Homo sapiens”。根据数据库的富集分析，选取P值前10 位的结果进行可视化处理。

1.7 分子对接

选取前5 个核心靶点及核心成分，从RCSB PDB数据库与PubChem 数据库中分别下载核心靶点与核心成分的结构。将结构文件导入PyMol 2.5.2 及AutoDockTools 1.5.6 软件进行分子对接。

2 结果

2.1 桃仁红花煎的活性成分及其靶点的结果

初步筛选出桃仁红花煎的活性成分，并补充文献检索所得的结果，最终收集到存在靶点的活性成分201 个，其中有35 个为共有活性成分，收集到靶点3170 个。利用UniProt 数据库对靶点进行注释并去重，得到303 个潜在治疗靶点基因。

2.2 MIRI 靶点整合

整合数据库的结果，共获取527 个MIRI 疾病靶点。

2.3 桃仁红花煎治疗MIRI 靶点韦恩图制作

将活性成分靶点与疾病靶点进行交集分析，获得86 个桃仁红花煎治疗MIRI 共同靶点。

2.4 桃仁红花煎的活性成分及靶点的网络构建

运用Cytoscape 3.8.2 软件，绘制出桃仁红花煎“活性成分-靶点”网络并获取桃仁红花煎治疗MIRI的关键成分，见图1 及表1。

图1 “活性成分-靶点”网络

2.5 PPI 网络图的构建

将数据结果导入Cytoscape 3.8.2 软件，得到86个节点与1235 条边，绘制出桃仁红花煎成分-MIRI 靶点PPI 网络图，见图3。

图3 GO 富集分析

图2 桃仁红花煎成分-MIRI 靶点PPI 网络

2.6 GO 和KEGG 富集分析

结果显示，在GO 富集分析中，共预测到了381个条目，生物过程中富集最高的是凋亡过程的负调控，细胞组成富集最高的是细胞外间隙，分子功能富集最高的是酶结合，见图4。

图4 KEGG 分析

KEGG 富集分析的结果显示桃仁红花煎治疗MIRI 的信号通路共114 条，其中核心通路为肿瘤坏死因子信号通路（tumor necrosis factor，TNF）与缺氧诱导因子1（hypoxia inducible factor-1 signaling pathway，HIF-1）信号通路，见图5。

2.7 分子对接

根据自由能（affinity）对分子对接结果进行评估，自由能越小，提示受体与配体亲和力越强。结果显示，核心成分与核心靶点对接结果均小于-5 kcal/mol。其中，植物甾醇和TNF 的结合自由能为-9.7 kcal/mol，槲皮素和丝裂原活化蛋白激酶3（mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3）的结合自能为-9.4 kcal/mol，木犀草素和TNF 的结合自由能为-9.1 kcal/mol。这些成分及靶点自由能较高，可能具有较强的亲和性。

3 讨论

本研究通过网络药理学研究方法，预测得出桃仁红花煎的主要活性成分为槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素。其中，槲皮素通过上调沉默信息调控因子1 的表达，发挥对MIRI 的保护作用[10]。β-谷甾醇通过参与氧化应激、炎症反应和凋亡途径抑制MIRI 所致的心肌细胞损伤[11]。木犀草素预处理减少促炎细胞因子产生，抑制MIRI 导致的心肌细胞凋亡[12]。以上结果显示桃仁红花煎的主要活性成分能一定程度上发挥抗MIRI 作用。

本研究结果显示，蛋白激酶B（protein kinase B，AKT1）、白介素6（interleukin-6，IL-6）、TNF 等靶点可能在桃仁红花煎治疗MIRI 中发挥关键的作用。AKT1具有调控细胞增殖与凋亡的功能，能够减轻缺血-再灌注损伤所致的心肌损伤[13]。在MIRI 进程中，促炎因子IL-6、TNF 血清含量的降低，有利于减轻心肌细胞炎症反应，从而减少心肌梗死面积[14]。丹参可下调AKT1，调控血小板活性，发挥拮抗MIRI 的作用[15]。红花活性成分可降低MIRI 大鼠血清中IL-6、TNF-α 的含量，达到保护心肌细胞的作用[16]。以上研究一定程度上证明了桃仁红花煎的主要药物如丹参、红花等可以调节重要的核心靶点治疗MIRI。

分子对接结果显示，桃仁红花煎的核心成分与核心靶点均有较好的亲和力，进一步验证了上述活性成分及靶点预测。

KEGG 结果，显示桃仁红花煎治疗MIRI 的主要通路可能为TNF 信号通路与HIF-1 信号通路。研究显示，TNF 信号通路的上调会导致下游靶点核因子-κB 水平的升高，进一步加剧MIRI[17]。HIF-1 信号通路可通过抑制Toll 样受体4 信号通路的表达，减轻MIRI 大鼠体内炎症反应[18]。

现代研究发现，桃仁红花煎能抑制大鼠的IL-6和TNF-α 表达水平，进而达到抗动脉粥样硬化作用[19]。桃仁红花煎能显著抑制大鼠血小板聚集，并具有改善血液流变学的作用[20]。MIRI 的发生与动脉粥样硬化等心血管疾病以及血小板聚集、血液流变学异常等病理状态具有密切的关系。同时上述实验[19-20]所提及的作用靶点，与本次网络药理学研究预测结果具有一定的关联性。

综上所述，基于网络药理学方法预测发现桃仁红花煎可能通过多成分、多靶点以及多通路治疗MIRI，同时分子对接结果显示桃仁红花煎活性核心成分与靶点具有良好的结合性，进一步验证了网络药理学的结果。桃仁红花煎原本用于妇科病的治疗，然而经过近现代临床研究发现，桃仁红花煎对于心肌缺血类疾病具有良好的治疗效果。本研究通过对数据可视化处理分析，预测出桃仁红花煎干预MIRI 的复杂过程。临床实践与生物信息技术预测的结果不仅体现了中医“异病同治”的治则，更为进一步的动物实验研究提供理论参考。