刘若男，陈婉冰，杨 宏，胡亦清，鲁 群，董 军，刘 睿,4

(1.华中农业大学食品科学与技术学院，环境食品学教育部重点实验室，湖北 武汉 430070；2.武汉市蜂产品质量控制工程技术研究中心，湖北 武汉 430070；3.武汉市农业科学院环境与安全研究所，湖北 武汉 430070；4.农业农村部华中都市农业重点实验室，湖北 武汉 430070)

黄烷-3-醇类膳食多酚包括儿茶素、表儿茶素、原花青素及其衍生物，富含此类化合物的膳食具有较好的抗氧化、抗炎作用[1-2]，对心血管疾病、神经退行性疾病和癌症等慢性疾病具有预防或缓解作用[3]。研究表明[4]，黄烷-3-醇类化合物经口摄入后，其在体内血液中的浓度仅能达到nmol/L～μmol/L水平，不足摄入量的1%[4]，而大量母体化合物进入结肠并被肠道微生物群降解，主要产生小分子酚酸，然后再被吸收至循环系统到达各组织或器官[5]。关于黄烷-3-醇类化合物在体内经肠道微生物代谢后对健康的影响机制仍未得到完整解析。目前，一些研究者将黄烷-3-醇类化合物对人类慢性疾病的影响和可能的干预机制归因于它们的肠道微生物代谢产物[6]。羟基苯甲酸、苯丙酸、苯乙酸、马尿酸、阿魏酸及其葡醛酸苷和硫酸酯缀合物均被证明比母体化合物具有更强的生物活性[7-8]。可见，黄烷-3-醇类化合物发挥有益作用的能力与其肠道微生物的代谢产物密切相关。尽管对黄烷-3-醇类化合物的肠道微生物代谢产物的定性鉴定取得了一定的进展[5,9-10]，但其精准定量仍需重点突破，该成果可以揭示黄烷-3-醇类化合物的生物利用度和体内外生物活性。

摄入富含黄烷-3-醇类化合物的膳食后，体内主要出现黄烷-3-醇母体化合物及其Ⅱ-相衍生物、5-碳开环代谢产物(主要为苯基戊内酯类和苯基戊酸类及其Ⅱ-相衍生物)、小分子酚酸以及Ⅱ-相衍生物等3类代谢产物，其中，后2类代谢物含量在血浆、尿液和粪便中占主导。研究表明[11]，这些代谢产物主要以葡萄糖醛酸化和硫酸酯化Ⅱ-相代谢产物的形式存在。Ⅱ-相代谢产物同样也是其他多酚类化合物的特征代谢产物，但由于其标准品不易获得，常采用酶解打破葡萄糖醛酸键或硫酸酯键定性或定量多酚代谢产物前体。Kahle等[12]对血清和尿液样本酶解后，实现了对5-咖啡基奎宁酸、4-对香豆基奎宁酸、咖啡酸、(-)表儿茶素、根皮素、槲皮素及马尿酸等代谢产物的定量分析。

目前，常使用三重四极杆(QQQ)、飞行时间(TOF)、四极飞行时间(Q-TOF)、线性离子阱(LTQ)、静电场轨道离子阱(Orbitrip)等方法对复杂生物样品进行精确靶向定量。其中，QQQ扫描速度快、干扰小，具有较宽的线性范围，广泛用于定量分析，但是需要依赖目标待测物的标准品建立分析方法[13-14]；TOF、LTQ和Orbitrip均为高分辨和高灵敏度的质谱仪，皆可提供精准质量数、多级碎片离子质量和准确的离子色谱，但扫描速度慢、线性范围窄，在定量方面的应用较少，但随着质谱数据分析软件的开发以及新定量模式的需求，也逐渐应用于靶向定量分析[15-18]。

本研究拟使用葡萄糖醛酸酶和硫酸酯酶打破Ⅱ-相代谢产物的酯键，并结合标准品开发定量方法，采用超高效液相色谱-三重四极杆-串联质谱(UHPLC-QQQ-MS)法靶向定量分析黄烷-3-醇类化合物及其主要代谢产物，同时测定其在血浆、粪便、尿液等不同生物基质中的含量，并从灵敏度、精确度、稳定性等方面进行方法学验证。希望为黄烷-3-醇类化合物的靶向定量研究提供方法，为选择与健康相关的有效生物标志物提供参考。

1 实验部分

1.1 主要仪器与装置

Acquity UPLC H-Class PLUS超高效液相色谱系统：美国Waters公司产品，由 Acquity UPLC QSM四元溶剂管理系统、Acquity UPLC FTN样品管理系统、Acquity UPLCPDA检测系统组成；Xevo TQ-S三重四极杆质谱仪：美国Waters公司产品，配有电喷雾离子源及Masslynx数据处理软件；Gradient A10 Milli-Q超纯水器：法国Milli-pore公司产品；Vortex-2500M多管涡旋混合器：中国力辰科技公司产品；LHS-100CH恒温培养箱：中国上海一恒公司产品；YTLG-12A冷冻干燥机：中国上海叶拓公司产品。

1.2 主要材料与试剂

5-(3-羟基苯基)-戊内酯(纯度98.78%)、 4-羟基-5-(3-羟基苯基)-戊酸(纯度98.13%)：由药明康德新药开发有限公司合成；高香草酸标准品：中国苏州爱玛特生物科技有限公司产品；原花青素A1(纯度95.23%)、原花青素A型三聚体(纯度97.34%)：从花生红衣原花青素中分离得到；其余标准品均为上海源叶生物科技有限公司产品。硫酸酯酶(酶活力值为10 kU)、葡萄糖醛酸酶(酶活力值为100 kU)：来源于罗曼蜗牛，美国Sigma公司产品；乙腈、甲醇：均为色谱级，美国Fisher公司产品；甲酸(色谱级)：德国 Merck公司产品；血浆、尿液、粪便：取自C57BL/6健康小鼠，购自华中农业大学实验动物中心。

1.3 实验条件

1.3.1色谱条件 色谱柱：Thermo Hypersil GOLD C18柱(100 mm×2.1 mm×1.9 μm)；流动相：A相为0.1%甲酸，B相为含0.1%甲酸的乙腈；柱温40 ℃；洗脱梯度：0～2 min(95%A)，2～10 min(95%～60%A)，10～12.5 min(60%～5%A)，12.5～15 min(5%～95%A)。

1.3.2质谱条件 电喷雾离子源(ESI)，毛细管电压3 kV，脱溶温度500 ℃，脱溶气(N2)流速750 L/h。使用0.1、0.5、5、50 mg/L标准品溶液从低浓度到高浓度进行质谱调谐分析，直至获得化合物响应值最高的子离子信息；然后选择该离子进行后续优化，通过手动调谐的方式优化各分析物的MS/MS参数(锥孔电压和碰撞能量)，使子离子的响应值达到最高。采用多反应监测(MRM)模式，选择最敏感的跃迁(母离子和子离子)进行定量。使用MassLynx 4.1软件进行数据采集和处理。

1.4 标准溶液的配制

1.4.1调谐标准品的配制 分别精密称取适量的各标准品，加入70%甲醇溶解，配制2 000、200、50、0.5、0.1 mg/L标准品溶液，用于调谐分析。

1.4.2混合标准品的配制 根据调谐过程中化合物定量子离子响应值的差异，将33种标准品分成4组，质谱响应较低时，需要该化合物在混合标准品溶液中以较高的浓度存在，以保证同一条件下每种化合物都能得到较均衡的响应值。4组混合标准品溶液的最高浓度分别为25、50、100、200 mg/L，取4组等体积标准品溶液，配制混合标准品溶液S1，依次稀释得到S2～S9，稀释梯度列于表1。根据化合物对应的浓度范围和响应的峰面积，使每种化合物都得到1个MRM函数。

表1 各组混合标准品的浓度和稀释梯度Table 1 Concentration and dilution gradient of each group of mixed standards

1.5 样品处理方法

1.5.1尿液样品 使用代谢笼收集小鼠24 h内的尿液样本，并定容至8 mL，所有尿液样本过0.22 μm滤膜，冻存于-80 ℃。分析前取出，对尿液样本解冻、涡旋，然后取0.5 mL尿液样本，加入0.25 mL混合酶(含1 000 U 葡萄醛酸酶和100 U 硫酸酯酶)，在37 ℃水解3 h，再加入20 μL 6 mol/L盐酸中止反应，以12 000r/min离心10 min，取上清液，过0.22 μm滤膜，用于代谢产物含量的测定[19-20]。

1.5.2粪便样品 称取100 mg粪便，加入200 mg玻璃微珠和1 mL 50%甲醇进行涡旋，混合均匀后，以10 000 r/min离心10 min，取上清液，分析测定前过0.22 μm滤膜。

1.5.3血浆样品 采血于肝素钠抗凝管，以10 000 r/min离心10 min，取上清液，密封，冻存于-80 ℃。样品前处理时，将其取出放于冰上30～60 min，待样品完全溶解后，取100 μL血浆，加入100 μL混合酶，在37 ℃水解3 h，水解结束后，加入500 μL含2%甲酸的乙腈溶液，超声10 min，以10 000 r/min离心10 min，用于沉淀蛋白；取上清液，真空冷冻干燥后保存。测定时取出样品，加入100 μL含0.1%甲酸的甲醇溶液复溶，涡旋，然后以12 000 r/min离心10 min，吸取上清液，用于UPLC-MS/MS检测[21-22]。

2 结果与讨论

2.1 处理条件的优化

根据文献[19-22]报道，优化了3种不同生物基质的处理方法，以加标回收率作为优化指标，优化方案示于图1，优化效果示于图2。使用方案一处理尿液样本时，黄烷-3-醇类化合物均出现了未检出的结果，包括儿茶素、表儿茶素、原花青素B1、原花青素A1、三聚体，这可能是因为pH值较高，黄烷-3-醇类化合物在偏酸性的条件下更稳定，经过调整pH值后，这一现象得到改善，且回收率范围更合理。在粪便样本处理过程中也同样存在pH值较高的现象，将0.1%乙酸调整为2%甲酸后，可以提高大多数化合物的回收率。拟定的血浆样本处理方案的回收率能够达到方法学验证标准，未进行优化。

图1 优化不同基质的处理方案Fig.1 Processing schemes of optimized different matrixes

注：a.尿液样本；b.粪便样本

2.2 质谱参数的优化

黄烷-3-醇类化合物的代谢产物主要为小分子酚酸类。本实验在电喷雾负离子模式下对质谱条件进行优化，每种化合物的母离子Q1[M-H]-出现后，对Q1进行碰撞解离，通过子离子扫描，得到目标化合物的特征碎片离子。在此基础上，对去簇电压和碰撞能量等参数进行优化，使分子离子对的信号达到最强。根据化合物的特征离子对、目标子离子的出峰时间，以及对应的去簇电压和碰撞能量等，建立MRM定量方法的基本信息。33种化合物优化后的质谱参数列于表2。

表2 33种代谢产物的质谱参数Table 2 Mass spectrometric parameters of 33 metabolites

2.3 方法学验证

2.3.1线性分析 以标准品浓度(x)为横坐标，峰面积比值(y)为纵坐标，最小二乘法进行回归计算，即得标准曲线的线性方程和线性相关系数，结果列于表3。可见，33种化合物在线性范围内具有较好的线性关系。

表3 33种代谢产物的回归方程、线性关系、检出限和定量限Table 3 Regression equation, linearity, LOD and LOQ of 33 metabolites

2.3.2灵敏度 利用一系列已知低浓度混标与空白样品的测量信号进行比较，确定各化合物的检出限(LOD)为3倍信噪比对应的浓度，定量限(LOQ)为8倍信噪比对应的浓度，结果列于表3。可见，检出限的最小值为0.006 3 mg/L，对应的化合物有表儿茶素、原花青素B1、原花青素A1、原花青素三聚体、对香豆酸，这些化合物几乎没有噪音干扰；检出限的最大值为2.5 mg/L，对应的化合物仅有3,4-二羟基苯乙酸，该化合物的特征子离子响应相对较差；33种化合物的定量限在0.015 6～10 mg/L之间，最大值对应的化合物仍是3,4-二羟基苯乙酸。

2.3.3回收率 样品在处理过程中会存在一定的损失，因此，定量分析中回收率的评估尤为重要。回收率评估流程如下：将标准品加入原始空白生物基质样本中，按照1.5节方法处理样品，同时在经过前处理的各基质样品中加入标准品，分析空白样本中各化合物的含量(以峰面积表示)，按照以下公式评估回收率。

回收率=(样本提取前的峰面积-空白样品的峰面积)/(样本提取后的峰面积-空白样品的峰面积)×100%。33种化合物在血浆、尿液、粪便中的回收率列于表4。结果表明，不同基质的回收率大多在70%～120%之间，其中，粪便样品的加标回收率最好，血浆样品次之。Quifer等[24]研究表明，酶解处理和孵育过程对样品中游离态的多酚和酚酸在回收率方面有负面影响，酶水解可能是导致这一现象的原因。

2.3.4基质效应 将尿液、血浆或粪便等生物样本提取后，加入标准品溶液分析并制作校准曲线，并用甲醇制备标准品溶液获得标准曲线斜率，通过比较以上结果来评价基质效应。结果以100%为基准进行比较，基质效应为正，即为增强效应，基质效应为负，则为减弱效应[23]。33种化合物在血浆、尿液、粪便中的基质效应列于表4。可见，化合物在粪便和尿液样品中的基质效应表现为轻微的离子抑制作用，而在血浆样品中则表现为离子增强作用。虽然有些化合物的基质效应较高，但大多数化合物的基质效应介于±20%之间可被接受。

表4 33种化合物在粪便、尿液、血浆中的回收率及基质效应Table 4 Recovery and matrix effect of 33 compounds in feces, urine and plasma

续表4

2.3.5日内和日间精密度 对混合标准品、血浆、尿液和粪便4种样本进行日内和日间精密度评估，混标选择S6(A组0.5 mg/L、B组1 mg/L、C组2 mg/L、D组4 mg/L)进行评估；血浆、尿液、粪便按1.5节条件进行前处理后，用生物样本提取液配制与混合标准品S6等浓度的混合标准品进行评估。33种化合物的日内和日间精密度示于图3。可见，标准品以及不同基质的日内、日间精密度均小于15%，表明方法的精密度和稳定性良好。

图3 日内和日间精密度Fig.3 Inter-day and intra-day precisions

3 结论

本研究使用超高效液相色谱-三重四极杆-串联质谱测定血浆、尿液和粪便中黄烷-3-醇类化合物的主要肠道微生物代谢产物，依据化合物子离子响应值差异，确定了33种化合物在混合标准品中的浓度，使所有化合物在同一条件下得到适宜的响应；同时，在15 min分析时间内，使混合标准品中33种化合物达到较好的分离。经方法学验证，33种化合物具有较好的线性关系，以尿液、粪便和血浆为研究材料，日内、日间精密度RSD值均在15%以下，基质效应介于±20%之间，回收率在70%～120%之间。该方法灵敏、准确、稳定、抗基质干扰能力较强，可以为黄烷-3-醇类化合物靶向定量的深入研究提供参考。