袁薪茹，闫吉军，范金石，褚金芳,3

(1.青岛科技大学海洋科学与生物工程学院，山东 青岛 266042；2.中国科学院遗传与发育生物学研究所，国家植物基因研究中心(北京)， 北京 100101；3.中国科学院大学现代农业科学学院，北京 100039)

植物小肽激素是植物激素研究领域的一个新兴分支，是一类天然氨基酸以不同组成和排列方式构成的活性生物分子，通常可以与周边细胞膜表面的受体激酶(主要是富含亮氨酸的类受体蛋白激酶)相互作用，在植物细胞间信息交流中发挥着关键作用[1-2]。随着技术手段的快速发展和研究的不断深入，人们陆续在番茄及其他植物中发现了与植物免疫、细胞分化、生殖与发育等植物生理活动密切相关的系统素、植物磺肽素、CLE (CLAVATA3/Embryo surrounding region)和快速碱化因子等数十种小肽激素[1-2]，其中CLE作为维持干细胞增殖与分化平衡的关键调控因子[3],在低等植物和高等植物(包括单子叶植物和双子叶植物)中均有分布。CLE小肽结构具有一定的保守性，其保守序列由14个氨基酸组成，其中12个氨基酸序列(十二肽基序)足以使CLE发挥其生理作用[4]。根据生物信息学预测，在拟南芥中有32个CLE成员[5]，在水稻中有47个CLE成员[6]，其他物种中也含有类CLE同源基因[7]。在CLE家族中，目前研究较为透彻的只有CLV3、导管分化抑制因子(tracheary elements differentiation inhibitory factor, TDIF)等少数成员，还有大量的预测小肽尚未得到证实。植物体内潜在的CLE小肽及其类似物的数量十分庞大，因此CLE小肽的筛选与结构鉴定极具挑战性。质谱技术具有准确性高、灵敏度高、选择性强等优点，在CLE小肽的发现、结构鉴定和定量分析中发挥着关键作用[8-9]，小肽的质谱碎裂规律和碎片信息是小肽定性、定量分析的重要依据。

本工作拟采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法(UPLC-QTOF MS)系统性地研究CLV3、CLE19、CLE40、TDIF和GmRIC1(Glycine max Rhizobia-induced CLE1)5种典型的CLE小肽激素的质谱特征，并利用合成的1个CLE类似小肽(CLEL)对碎裂规律进行验证。通过研究CLE小肽的碎裂规律和特点，提出利用质谱手段对未知CLE小肽进行筛选与结构鉴定的可能性思路，希望可以帮助生物学家准确定量分析CLE小肽以及寻找和鉴定新的CLE小肽。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

AcquityTMUPLC-Synapt G2 QTOF-MS联用仪：美国Waters公司产品，配有电喷雾离子源(ESI)及MassLynx4.1数据处理系统。

CLV3、CLE19、CLE40、TDIF、GmRIC1：纯度>95%，均由杭州中肽生化有限公司合成；CLEL：由中国科学院遗传与发育生物学研究所许操研究员实验室提供，各小肽标品的氨基酸序列等信息列于表1；乙腈、甲醇：色谱纯，美国Thermo Fisher公司产品；甲酸：色谱纯，美国Sigma-Aldrich公司产品；其他化学试剂均为分析纯或更高纯度级别；去离子水(电阻率≥18.2 MΩ)：由Milli-Q纯化水净化系统制备。

表1 CLE小肽及CLEL的氨基酸序列和一级质谱特征准分子离子Table 1 Amino acid sequences and typical quasi-molecular ions of five CLE peptides and CLEL

采用去离子水配制小肽标准储备液(1 g/L)，放于-80 ℃冰箱中保存；用含0.1%甲酸的5%乙腈酸性水溶液逐级稀释储备液，配制工作溶液。

1.2 实验条件

1.2.1色谱条件 色谱柱：Waters Peptide CSH C18柱(2.1 mm×100 mm×1.7 μm)；流动相：A为0.1%甲酸-水溶液，B为0.1%甲酸-乙腈溶液；梯度洗脱程序：0～1 min(99%A)，1～10 min(99%～43%A)，10～13 min(43%～0%A)，13～14 min(0%A)，14～16 min(0%～99%A)；流速0.3 mL/min；柱温为室温；进样量5 μL。

1.2.2质谱条件 电喷雾电离源正离子模式(ESI+,m/z50～1 500)，毛细管电压3.0 kV，样品锥孔电压30 V，离子源温度100 ℃，脱溶剂气温度350 ℃，样品载气流量30 L/h，脱溶剂气流量800 L/h，采用亮氨酸脑啡肽为质量校准溶液(浓度1 mg/L，流速5 μL/min)。二级质谱实验采用氩气作为碰撞气，碰撞诱导解离(CID)模式，除了设定碰撞电压外，其他实验条件与一级质谱参数一致。

2 结果与讨论

2.1 CLE家族小肽激素的一级质谱图分析

选取的5种典型CLE小肽激素均可检测到多种多电荷离子，示于图1，TDIF的最强准分子离子为双电荷，而其他4种小肽的最强准分子离子均为三电荷。结合小肽序列结构可知(表1)，上述5种典型CLE小肽的最强准分子离子携带电荷数与其碱性氨基酸残基的数目呈正相关，小肽的质子化位点可能是空间上远离的碱性氨基酸侧链及端氨基，这一规律可能同样适用于其他CLE小肽。

注：加粗表示准分子离子；*表示脱水离子

从检测灵敏度的角度出发，最强准分子离子占所有准分子离子的比例及其相关CID碎片离子是小肽定量分析的关键。除CLE19外，其余小肽的最强准分子离子峰比例大部分达到90%以上，这有利于谱图解析和定量分析，示于图2a。谱图分析过程中，除TDIF外，其余小肽均发生了脱水现象，脱水离子峰的产生可能主要来源于氨基酸侧链(O、S、T、Y)上的羟基。脱水离子的比例随着电荷数目的增加而增加，CLE40和CLV3的四电荷准分子离子甚至接近100%，中性丢失形成了[M+4H—H2O]4+，示于图2b。随着样品锥孔电压的增加，脱水离子所占比例越来越大(结果未展示)，可见一级质谱的脱水离子是源内碎裂的结果。因此，在对CLE家族进行分析尤其是定量分析时，需要特别关注含有存在羟基的氨基酸残基的小肽，防止源内碎裂给分析灵敏度带来不利的影响。另一方面，该结果表明不同电荷的小肽离子稳定性具有较大差异，电荷数越多越容易碎裂。不同电荷的小肽准分子离子峰的碎裂特征将在下文继续探讨。

图2 携带电荷数目对CLE小肽准分子离子强度(a)及脱水效率(b)的影响Fig.2 Influence of the charge state of CLE peptides parent ions on corresponding ion abundance (a) and dehydration efficiency (b)

小肽多电荷离子的分布情况是影响检测灵敏度及谱图解析难度的重要因素。除小肽自身的结构特征外，流动相组成及工作溶剂的选择也非常关键。Kebarle等[10]研究发现，小肽离子化后的电荷状态与工作溶剂密切相关。气相状态下具有高质子亲和势的溶剂(乙腈、丙酮等)会使小肽的电荷数减少，而具有低质子亲和势的溶剂(如甲醇和水)对小肽离子的电荷状态没有影响。为此，本研究将流动相B由乙腈换为甲醇，以期减少低电荷离子丰度，提升最强准分子离子峰的比例。然而，实验结果表明，甲醇体系下各小肽最强准分子离子峰的比例变化不显著，而且出现色谱峰变宽、峰分叉及灵敏度下降等问题。故后续实验仍然采用乙腈-水溶液作为流动相。

2.2 CLE家族小肽激素的二级质谱图分析

在相同的质谱条件下，GmRIC1的双电荷、三电荷和四电荷准分子离子的二级质谱图示于图3。可以看出，在20 V碰撞电压下，[M+2H]2+基本未碎裂，[M+3H]3+大部分被裂解，而[M+4H]4+几乎完全碎裂成子离子，特征碎片离子峰较少。可见，小肽准分子离子所带电荷越多，越容易发生碎裂，此结果与一级质谱研究中的脱水程度与所带电荷数的关系相符，也与文献[11]报道一致。进一步分析表明，最强准分子离子[M+3H]3+产生的碎片离子最丰富且强度较高，更适合用于小肽结构鉴定。另一方面，小肽的定量分析时，为了获得最佳的分析效果，一般选择最强的准分子离子为母离子，选择丰度高的特征碎片离子为子离子。因此，本实验选择每个CLE小肽最强的准分子离子探索CID碎裂规律。

注：a.[M+2H]2+;b.[M+3H]3+;c.[M+4H]4+

在CID碎裂模式下，碰撞能量是影响二级质谱图质量的主要因素。在低碰撞电压(10 V/15 V)下，小肽CLV3无法有效裂解，可获取的子离子信息较少；当碰撞电压升高(18 V/20 V)，小肽产生的碎片离子峰较多，强度高且稳定，适合对其进行定性定量分析；继续升高碰撞电压至25 V时，特征碎片离子峰减少且强度降低，示于图4。综合对比，CLV3、CLE19、CLE40、TDIF以及GmRIC1的最佳碰撞能量分别为18、15、18、20、18 V。双电荷TDIF需要的碰撞能量比三电荷的其他小肽高，这进一步表明，小肽准分子离子碎裂程度与其所带电荷的数目正相关。鉴于CLE家族小肽的高度结构保守性，其他CLE小肽的最佳碰撞能量可能也在15～20 V之间，实际应用时需要考虑最强准分子离子的电荷数，电荷数越多，能量越低。

注：a.10 V；b.15 V；c.18 V；d.20 V；e.25 V

在最佳碰撞能量下，CLE家族5种小肽激素的二级质谱图示于图5。可以看出，在CID模式下，CLE小肽主要产生b型和y型碎片离子，还有少量的a型离子。CLV3的碎片离子中，b3、b6、y4的相对丰度最高，b5、y6、y7次之，表明3位缬氨酸和4位脯氨酸、6位甘氨酸和7位脯氨酸以及8位天冬氨酸和9位脯氨酸之间的肽键最容易断裂，5位丝氨酸和6位甘氨酸之间的酰胺键次之。CLE19的碎片离子中，b3、y6的相对强度最高，b5、y4、y7次之，表明3位异亮氨酸和4位脯氨酸、6位甘氨酸和7位脯氨酸的肽键最容易断裂，5位苏氨酸和6位甘氨酸以及8位天冬酰胺和9位脯氨酸之间的肽键次之。CLE40的碎片离子中，b3、y4的相对强度最高，b5、b6、y7次之，说明3位缬氨酸和4位脯氨酸、8位天冬氨酸和9位脯氨酸之间的肽键最容易断裂，5位苏氨酸和6位甘氨酸以及6位甘氨酸和7位苏氨酸之间的肽键次之。GmRIC1的碎片离子中相对强度最高的为b3、b5、b6、y4，说明酰胺键的断裂容易发生在3位丙氨酸和4位脯氨酸、5位谷氨酸和6位甘氨酸、6位甘氨酸和7位脯氨酸以及8位天冬氨酸和9位脯氨酸。TDIF的碎片离子中，b8、b9、b10、b11、y2的相对强度最高，b3、y4次之，说明末端5个氨基酸之间的肽键均容易断裂，3位缬氨酸与4位羟脯氨酸之间的肽键次之。综合对比分析，CLE小肽N端的精氨酸或组氨酸的羧基位置很难碎裂，均未检测到b1离子，而y1、y4、y7和b3离子则普遍存在于各CLE标品的二级质谱图中，尤其以y4和b3离子丰度较高。在CLE小肽结构中，脯/羟脯氨酸的氨基(特别是氨端起4位和9位脯/羟脯氨酸)以及甘氨酸的氨基和羧基端最容易发生断裂。根据自由移动质子引发的电荷诱导碎裂模型， b/y离子形成的主要驱动力是电荷在肽段上的转移。在外界能量激发下，电荷向热力学更稳定的位置移动，当电荷移动到肽键上的氮原子时，酰胺键的电子云密度分布发生改变，从而使肽键键能减弱而更容易碎裂[12]。因此，肽键碎裂难易的关键因素是肽键中氮原子的质子亲和势。脯氨酸作为唯一的环状氨基酸，其氮原子的pKa(10.6)大于其他氨基酸，更容易结合质子。在这种情况下，小肽链中脯氨酸的氨基侧肽键比其他位置更容易发生断裂，从而产生相应的高丰度b/y离子。文献[11]报道表明，烟草系统素也容易在脯氨酸的氨基端发生断裂。可见，脯氨酸氨基侧肽键容易碎裂形成相应的y离子及互补b离子这一规律可能具有普适性，可用于其他活性小肽的定性定量分析。目标小肽中都存在相对强度较高的b5、y7以及b6、y6互补离子对，对于CLE家族其他小肽激素的定量分析具有重要的参考意义。

注：a.CLV3；b.CLE19;c.CLE40;d.TDIF;e.GmRIC1

CLE家族的小肽激素具有特定的保守结构域，这些保守结构提供了受体结合和信号转导的关键作用位点，是该家族成员间具有显著功能冗余性的重要原因。6位甘氨酸在中心区域扭折结构的形成中发挥着关键作用。4、7、9位脯氨酸构成了典型的聚脯氨酸结构域，通常形成刚性的螺旋结构，能够用作蛋白-蛋白作用域或组装多肽链。1位精氨酸或组氨酸对前体蛋白剪切定位及成熟小肽的形成十分重要，12位组氨酸或天冬酰胺则普遍存在于拟南芥、水稻等物种的CLE结构中。这些保守结构的存在与否可以作为CLE小肽激素筛选的重要判断依据。结合前述质谱碎裂特点， CLE小肽激素定性分析的关键碎片离子为y1(12位组氨酸或天冬酰胺)、b1(1位精氨酸或组氨酸)、b4(包含4位脯氨酸)、y3(包含9位脯氨酸)。在现有条件下，b1离子难以检出，而b4和y3离子的质荷比可能性太多(包含可变氨基酸)，使用价值有限。综合判断，y1离子是CLE分析的关键离子之一。6位甘氨酸位于肽链中间，无法直接通过b和y型离子判断其存在与否。而甘氨酸两端的肽键容易碎裂，可以通过中性丢失分析，间接推测6位甘氨酸的存在(b7-b6或 y8-y7)。同样的，脯氨酸氨基侧的肽链容易碎裂，也可通过类似的思路间接解析。因此，上述保守离子可作为小肽筛选的依据，构建合适的质谱筛选方法(数据依赖或非数据依赖)，帮助研究人员探寻新的CLE小肽激素。

2.3 CLE家族小肽质谱碎裂规律验证

为了检验上述总结的规律，实验合成了1个与CLE结构十分相似的小肽CLEL，其基本信息列于表1。根据上文研究，CLE小肽的质谱特征为：1) 最强准分子离子峰携带的电荷数目为空间分散的碱性氨基酸个数加1；2) 最强准分子离子峰的最佳碰撞能量在15～20 V之间，双电荷需要20 V左右，三电荷需要18 V左右，四电荷的最佳碰撞能量更低；3) 在CID模式下，主要产生y1、y4、y7和b3离子，其中b3和y4为高丰度离子。据此，推测CLEL的最强准分子离子为三电荷离子，最佳碰撞能量为15～20 V，容易在脯氨酸氨基侧及甘氨酸两侧断裂形成b3、y9、y4、y8、b5、y7、b6和y6离子。CLEL的最强准分子离子为[M+3H]3+,最佳碰撞电压为18 V，碎片离子中b3、b5、b6、y4、y6的丰度最高，示于图6，该结果与推测结果完全契合。上述质谱碎裂规律对CLE小肽的相关研究具有较强的实用性。

图6 在最优碰撞电压(18 V)下，CLEL的一级质谱图(a)和准分子离子[M+3H]3+的二级质谱图(b)Fig.6 MS spectrum of [M+3H]3+ (a) and MS/MS spectrum of CLEL (b)under the optimized collision energy (18 V)

2.4 CLE家族小肽质谱碎裂规律的应用

在拟南芥的CLE十二肽基序中[13]，N端为组氨酸或精氨酸，中间大多含有PxxPxPP表示脯氨酸，x表示可变氨基酸残基)片段，C端为天冬酰胺或组氨酸，6号位置为甘氨酸。根据出现频次，最普遍的保守序列为R-x-x-P-x-G-P-D/N-P-L-H-H/N。可见，对未知CLE小肽筛选与鉴定最有价值的是保守性极强的b1、y1、y2、y3、y4离子。结合CLE小肽的质谱碎裂特点和碎片离子的丰度分布，适合未知小肽筛选标准的子离子为y1和y4。基于上述依据，可对拟南芥26个十二肽基序以及其他物种中未知CLE小肽的质谱行为进行预测，结果列于表2。可以看出，由于结构的保守性，CLE小肽的子离子分布具有很大的相似性，因此可以提出1种基于质谱的未知CLE小肽的筛选策略。以Synapt G2 QTOF-MS的MSE(一种非数据依赖采集模式)为例，同时以低能量和高能量进行质谱扫描，典型条件如下：1) 低能量扫描，正离子扫描模式(ESI+，m/z100～800)，碰撞能量0 V，可采集一级质谱图；2) 高能量扫描，正离子扫描模式(ESI+，m/z100～1 500)，碰撞能量18 V，可采集二级质谱图。数据采集后，在高能量总离子流图(TIC)中采用表中预测的y1(133.061/156.077)和y4(406.220/383.204/421.195/303.167/333.177/449.237)离子提取色谱图(EIC)，筛选出保留时间相同的谱峰，即同时具有y1和y4子离子的化合物，然后运用MassLynx软件的谱图合并(combine spectrum)功能分别提取这些化合物的一级和二级质谱图，分析母离子和子离子分布，推测小肽序列。为了考察这一策略的可行性，本文假定CLEL是一种未知CLE小肽，利用MSE方法进行搜寻和序列鉴定，最终软件预测该化合物的小肽序列为RGVPAGODHPLH。CLEL的真实序列为RGVPAGODPLHH，预测的氨基酸组成与实际氨基酸组成基本相符，仅C端4个氨基酸的排列顺序有差异。可见，该筛选策略对未知CLE小肽的筛选和结构鉴定具有潜在的应用价值。

表2 拟南芥中已知CLE十二肽基序的质谱行为预测Table 2 Predicted mass spectrometric characteristics of CLE dodecapeptide motif in Arabidopsis

由于CLE家族的小肽激素内源含量低、数量庞大，而且具有一定的物种差异性，其筛选和鉴定是一项极富挑战性的工作。本文提供的筛选策略可用于CLE家族小肽的初步筛选，后期的工作可以从以下几个方面进行深入研究。首先，可根据需要进一步挖掘CLE小肽的保守性质谱特征，提高筛选的靶向性。通过提高碰撞能量、改变惰性气体、综合运用多种碎裂方式(如主要产生c型和z型子离子的电子转移碎裂，改善低质量碎片丢失效应的高能诱导裂解等)等方法获得CLE保守氨基酸残基(6位甘氨酸，4、7、9位脯氨酸，1位精氨酸/组氨酸)相关的高丰度碎片离子。其次，可利用高灵敏的多反应监测(MRM)模式作为辅助提高筛选效率。通过质谱碎裂规律和生物信息学预测的CLE结构可以推算出典型的子离子，从而给出MRM检测的离子对，设置合适的信号阈值触发二级质谱扫描，从而实现对可能真实存在的CLE小肽的检测和结构确定。最后，与生物学家合作，结合遗传学研究，发现和鉴定不同物种中的CLE小肽激素。

3 结论

本工作采用UPLC-QTOF MS联用技术研究了5种典型CLE小肽激素的一级质谱特征和最强准分子离子的CID碎裂规律，发现CLE小肽的质谱行为具有较高的相似性。在ESI离子化方式下，5种CLE小肽的最强准分子离子携带的电荷均等于空间分散的碱性氨基酸残基数目加1。CID模式下进行二级质谱碎裂，最佳碰撞能量与母离子的电荷数相关，所带电荷数越高，需要的最佳碰撞能量越低，双电荷与三电荷的最佳碰撞能量分别约为20 V、15～18 V。最强准分子离子主要产生b型和y型碎片，也会产生少量的a型碎片。从碎裂位置看，脯/羟脯氨酸的氨基(特别是氨端起4位和9位脯/羟脯氨酸)以及甘氨酸的氨基和羧基端最容易发生断裂，从而形成高丰度的b3和y4离子。人工合成的CLE类似肽的质谱碎裂与上述规律完美契合，可为CLE小肽激素的定性定量分析提供科学依据。结合CLE的结构特点和质谱碎裂规律对拟南芥十二肽基序的质谱行为进行预测，提出一种非数据依赖的CLE筛选思路，有可能应用于新CLE小肽激素的发现与结构鉴定中。

致谢：感谢中国科学院遗传与发育生物学研究所许操研究员实验室提供的人工合成CLE类似肽标准品(CLEL)，感谢本实验室辛培勇博士对实验和数据分析提供的帮助和建议。