南宝,王悦,朱琳,刘翠,张睿

(1 青岛大学医学部中西医结合中心,山东 青岛 266021；2 淄博市第一医院病案科；3 青岛大学附属医院ICU)

神经调节素1β(NRG1β)可以通过抑制脑缺血后基质金属蛋白酶9(MMP9)等炎性因子的表达，下调水通道蛋白4(AQP4)水平而参与神经细胞存活以及功能修复[1-3]。大鼠大脑中动脉缺血再灌注(MCAO/R)损伤表现出神经功能障碍，预防性应用NRG1β干预可显著减小脑梗死体积以及神经细胞凋亡数量[4]，其机制可能与NRG1β的抗炎作用有关，但具体机制有待研究证实。在中枢神经系统生长分化过程中，细胞周期素依赖性激酶-5(Cdk5)可调节神经细胞的生存、移行和突触功能等[5-7]。其中，MCAO/R后缺血半影区的细胞凋亡与Cdk5的过度激活有密切关系，Cdk5抑制剂Roscovitine可阻断其作用[8]。MCAO/R损伤发生时，神经细胞内钙离子浓度升高而激活钙蛋白酶，导致Cdk5特定调节亚单位p35裂解成p25[9]，其活性存在的主要形式为Cdk5/p25，许多细胞凋亡相关底物均可与Cdk5/p25结合而启动细胞凋亡[10]。张睿等[11-12]研究显示，大鼠MCAO/R后应用NRG1β可显著改善其神经行为功能，但其作用机制尚未完全阐明。本研究试图探讨NRG1β对MCAO/R后大鼠的神经保护作用及其与Cdk5信号通路的关系，进一步阐明其神经保护作用机制。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康雄性Wistar大鼠50只，购自山东省实验动物中心，SPF级，体质量240～260 g。室温(23±2)℃条件下分笼饲养，12 h/12 h昼夜自然光照，自由饮食。术前禁食12 h，不禁水。

1.2 模型制备及实验分组

随机取10只大鼠作为假手术组(Sham组)，其余40只应用线栓法制备MCAO/R模型[13]。Sham组大鼠线栓置入颈内动脉(ICA)10 mm，不入颅。行改良神经功能缺损评分(mNSS)[14]，评分>10分视为造模成功，不成功的10只大鼠剔除。将造模成功的30只大鼠随机分为模型组(MCAO组)、治疗组(NRG组)和抑制剂组(Ros组)，每组10只。

1.3 各组处理方法

MCAO组：缺血2 h后拔除线栓，经颈外动脉(ECA)残端向ICA内注射0.1 mol/L PBS 5 μL；NRG组：缺血2 h后拔除线栓，经ECA向ICA内注射NRG1β(R&D Systems，USA)5 μL(2 μg/kg)；Ros组：缺血2 h后拔除线栓，经ECA向ICA注射Roscovitine 5 μL；Sham组拔除线栓后同步注射0.1 mol/L PBS 5 μL。所有大鼠均于再灌注22 h取材检测。

1.4 检测指标及方法

1.4.1神经行为功能评价 各组大鼠取材前均采用mNSS评分评定神经行为功能[14]，评分最低为0分，最高18分；得分越高，神经功能损伤越严重。

1.4.2甲苯胺蓝染色检测神经细胞形态 以100 g/L水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠(每组随机取5只)，经心脏灌注固定取脑。常规脱水、透明、包埋，自视交叉后方连续冠状位切片(厚度5 μm)，贴片；甲苯胺蓝染色。每张切片在高倍光镜(400倍)下随机观察顶-额叶皮质缺血半影区4个不重叠的视野，根据细胞的轮廓、膜完整性、染色深度、胞核固缩、尼氏体等指标判断细胞损伤变性程度，计数损伤的变性细胞数，计算变性细胞指数(DCI,DCI =变性细胞数/细胞总数×100%)。

1.4.3TUNEL方法检测细胞凋亡 石蜡切片脱蜡入水，按TUNEL试剂盒(Roche公司，美国)说明操作，HRP-抗体孵育，DAB显色，苏木精复染。光镜下呈棕黄色者视为凋亡细胞。阴性对照切片以PBS替代TdT探针染色，不着色。在顶-额叶皮质缺血半影区随机选4个视野，高倍光镜(400倍)下计数凋亡细胞数,计算凋亡指数(ACI,ACI=凋亡细胞数/细胞总数×100%)。

1.4.4免疫组化方法检测P35/P25阳性细胞 石蜡切片脱蜡、水化；热修复抗原，以体积分数0.03的H2O2孵育，PBS冲洗；然后滴加p35/p25兔单抗(C64B10，CST Co.Ltd.USA，1∶300)，37 ℃孵育1 h，PBS冲洗；滴加山羊抗兔IgG/HRP二抗(PV-6001，北京中杉金桥公司)，37 ℃孵育，PBS冲洗，DAB显色，苏木精复染，胞浆或(和)胞核呈棕黄色者为阳性细胞。阴性对照切片不加一抗，以PBS替代染色，不出现阳性着色。在顶-额叶皮质缺血半影区随机选4个高倍(400倍)视野，计数阳性细胞数，计算阳性细胞指数(PCI，PCI=阳性细胞数/细胞总数×100%)。

1.4.5Western blot检测P35/P25表达 取大鼠顶-额叶皮质缺血半影区脑组织100 mg，提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。按SDS-PAGE试剂盒(碧云天生物研究所)方法制备100 g/L分离胶和50 g/L积层胶，加样、电泳、转膜、封闭，然后加兔抗鼠一抗p35/p25(稀释度为1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜。加入山羊抗兔二抗IgG室温孵育1 h，TBST洗膜显影，用Bio-Rad 2000型成像系统扫描，Image J软件分析p35/p25及内参照β-actin灰度。计算目的蛋白相对含量(目的蛋白灰度/内参灰度值×100%)。

1.5 统计学分析

2 结 果

2.1 各组大鼠mNSS评分比较

与Sham组相比较，MCAO组、NRG组、Ros组mNSS评分显著升高，NRG组、Ros组mNSS评分较MCAO组均显著下降，差异有显著意义(F=151.31,P<0.05)；NRG组mNSS评分较Ros组略有下降，但差异无显著性(P>0.05)。见表1。

2.2 各组大鼠神经细胞损伤程度比较

MCAO组的神经细胞DCI较Sham组升高，NRG组和Ros组DCI较MCAO组显著降低，差异有显著性(F=128.21,P<0.05)；NRG组与Ros组DCI比较差异无显著性(P>0.05)。见图1和表1。

A：Sham组；B：MCAO组;C：NRG组；D：Ros组。箭头(↑)所示为变性细胞。甲苯胺蓝染色，400倍。

2.3 各组神经细胞凋亡比较

MCAO组ACI较Sham组显著升高，NRG组和Ros组ACI较MCAO组明显下降，差异均有显著性(F=136.79，P<0.01)；NRG组与Ros组ACI比较差异无显著性(P>0.05)。见图2和表1。

A：Sham组；B：MCAO组;C：NRG组；D：Ros组。箭头(↑)所示为凋亡细胞。TUNEL染色，400倍。

2.4 各组大鼠P35/P25阳性细胞数比较

MCAO组P35/P25 PCI较Sham组明显升高，NRG组较MCAO组明显减少，差异有显著性(F=105.00,P<0.01);MCAO组与Ros组PCI比较差异无显著性(P>0.05)。见图3和表1。

A：Sham组；B：MCAO组;C：NRG组；D：Ros组。箭头(↑)所示为P35/P25阳性细胞。免疫组化染色，400倍。

2.5 各组P35/P25表达比较

Western blot结果显示，MCAO组P35/P25表达较Sham组明显增强，NRG组较MCAO组明显降低，差异有显著性(F=74.34,P<0.01);MCAO组与Ros组P35/P25表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图4和表1。

表1 各组大鼠各指标检测结果比较

图4 大鼠顶-额叶皮质缺血半影区P35/P25表达的Western blot检测

3 讨 论

脑缺血再灌注引起的神经损伤主要包括兴奋性氨基酸释放、氧化应激、炎症反应、胶质反应、细胞内钙超载和神经细胞凋亡等病理机制。脑缺血中心区的神经细胞死亡以坏死为主，半影区则以凋亡为主。因此，抑制凋亡可以挽救处于早期凋亡状态的神经元，发挥神经保护作用[15]。神经调节素(NRGs)对脑缺血损伤诱导的神经细胞凋亡和胶质反应具有显著的抑制作用[4]。XU等[16]的研究显示，在永久性MCAO大鼠模型，脑缺血半影区的NRG1β表达显著增强。NRG1β激活其功能性受体酪氨酸激酶受体ErbB3或ErbB4，继而激活酪氨酸激酶，催化多肽链中的酪氨酸磷酸化，进而激活下游信号分子，发挥神经保护作用。

在神经变性疾病如阿尔茨海默病(AD)和帕金森病(PD)的病理生理过程中，Cdk5分子的活性失调[17-18]，继而引起其底物蛋白过度磷酸化，最终导致神经细胞凋亡和死亡[19]。RASHIDIAN等[20]对脑缺血模型研究发现，脑缺血后神经细胞内Cdk5过度激活，Cdk5通路过度激活可以解聚细胞骨架，从而导致神经细胞死亡。LOVE[21]的研究发现，p25较p35更能促进脑卒中后Cdk5的过度激活。因此，TAN等[22]提出，通过阻断Cdk5信号通路可能减少神经细胞死亡，从而为保护脑卒中损伤提供可行的治疗策略。本文研究结果显示，大鼠脑缺血2 h再灌注22 h后出现明显的神经行为功能障碍，缺血半影区神经细胞凋亡显著增加，神经细胞P35/P25表达显著增强；应用NRG1β干预治疗后，神经细胞P35/P25表达以及细胞凋亡率均有下降，神经细胞形态结构显著改善，mNSS评分显著下降，这与应用Cdk5特异性抑制剂Roscovitine的结果相似。表明NRG1β的作用机制可能是：通过降低P35/P25表达，进而抑制Cdk5的异常活化，从而发挥其抗凋亡、神经保护作用。新近研究发现，NRG-1在少突胶质细胞分化过程中具有重要作用，Nrg1-ErbB信号可能促进小胶质细胞活化，从而导致环磷酰胺诱导的膀胱炎的机械性超敏化，调节Nrg1-ErbB信号可能对治疗膀胱疼痛综合征/间质性膀胱炎(BPS/IC)疼痛症状具有治疗价值，而且这一作用机制与神经纤维髓鞘修复有密切关系[23]。DING等[24]研究认为，NRG-1可以通过PI3K-AKT-mTOR信号通路促使星形胶质细胞反向分化为少突胶质细胞，从而修复脊髓内神经纤维髓鞘的损伤。由此推测，NRG-1的释放呈递对中枢神经髓鞘再生过程有重要作用，与Cdk5调节神经细胞的生存、移行和突触功能有一定关系，但其详细机制有待进一步研究。

综上所述，NRG1β通过降低P35/P25的表达而抑制Cdk5信号通路的异常活化，从而发挥一定的抗凋亡以及神经保护作用。