席孝忠,李国强,肖雷,姚坤厚

(1 信阳市中心医院肿瘤外科,河南 信阳 464000；2 河南大学淮河医院普通外科)

结肠癌是消化道癌症主要表型，其恶性程度较高[1]，病死率位居恶性肿瘤前列，且呈逐年上升趋势，地域和人群差异显著[2]。研究表明，肿瘤干细胞分离和鉴定极大地推动了实体肿瘤如肺癌、消化道癌、生殖系统癌症等的深入研究[3-5]。细胞表面标志物，如CD133、CD44等，已被广泛用于各类恶性肿瘤干细胞的鉴定，如消化道癌等[6]。此外，miRNA是一类可以通过阻断mRNA翻译或者降解目标mRNA，从而发挥基因抑制的内源性非编码的小RNA。miRNA异常表达已被证实与癌细胞增殖、凋亡及转移等关联密切，并参与恶性肿瘤进程，其中miR-21在结肠癌中高表达[7]。本研究基于生物学预测网站发现成纤维细胞生长因子18(FGF18)为促癌基因[8]，是miR-21-5p靶基因之一，然而有关其在结肠癌中的研究尚未见报道。基于此，本研究主要探究了miR-21-5p调控FGF18表达对结肠癌肿瘤干细胞增殖、迁移和侵袭的作用及其机制。

1 材料和方法

1.1 实验材料

结肠癌HT29细胞(中国科学院上海细胞生物学研究所提供)；胰蛋白酶(Hyclone公司，USA)；DMEM/F12培养基(Gibco公司，USA)；细胞转染序列(上海奇骏牛物科技有限公司)；分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)；倒置光学显微镜(宁波舜宇光学科技(集团)有限公司)；细胞凋亡检测试剂盒(Sigma公司，USA)；miR-21-5p、FGF18引物合成(Takara，大连宝生物工程有限公司)；荧光定量PCR仪(ABI，USA)；BCA试剂盒(广州威佳生物科技有限公司)；Western blotting试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1CD133+/CD44+结肠癌干细胞分选 将结肠癌HT29细胞进行常规消化，参照既往文献的方法[9]，采用流式细胞分选技术分离筛选CD133+/CD44+结肠癌干细胞。将分选后细胞重悬，在37 ℃、含体积分数0.05 CO2条件下于6孔板中培养。以供后续细胞增殖、迁移和侵袭及凋亡等实验应用。

1.2.2CD133+/CD44+细胞培养、分组及质粒转染观察CD133+/CD44+细胞的生长状况，置于37 ℃、含体积分数0.05 CO2条件下继续培养。细胞传代培养过程中，对细胞进行离心和消化处理，吹打成单个细胞。重复上述操作，离心、弃细胞沉淀，吹打混匀成单细胞悬液后，转至6孔板相同条件继续培养备用。选取传代后3～5 d处于对数生长期的状态良好的细胞冻存备用。

取细胞分为如下6组：空白对照组(A组，Blank组)、阴性对照组(B组，NC组)、miR-21-5p模拟物组(C组，miR-21-5p mimic组)、miR-21-5p抑制剂组(D组，miR-21-5p inhibitor组)、FGF18沉默表达组(E组，si-FGF18组)、FGF18沉默表达+ miR-21-5p模拟物组(F组，si-FGF18+miR-21-5p mimic组)。按照不同分组转染质粒，具体转染操作如下。①Blank组：不转染任何序列。②NC组：转染空白质粒。③miR-21-5p mimic组：转染miR-21-5p mimic质粒。④miR-21-5p inhibitor组：转染miR-21-5p inhibitor质粒。⑤si-FGF18组：转染si-FGF18质粒。⑥si-FGF18+miR-21-5p mimic组：转染si-FGF18和 miR-21-5p mimic质粒。

1.2.3CCK-8法检测细胞增殖抑制率 细胞增殖测定根据细胞计数试剂盒说明书进行操作。取各组转染细胞混悬液加入96孔板中，每组设6个复孔，置于常规细胞培养箱培养。每孔加入CCK8溶液10 μL，继续培养。采用分光光度计测量450 nm波长处吸光度值，计算细胞增殖抑制率。

1.2.4Transwell小室法检测细胞的迁移和侵袭能力 取各组转染细胞，消化离心后重悬计数。按常规操作程序分别进行细胞迁移和侵袭实验。细胞迁移实验步骤如下：细胞培养后取Transwell小室，使用40 g/L多聚甲醛固定，5 g/L结晶紫溶液染色并拭去未迁移细胞，光学显微镜下观察并求取平均值。细胞侵袭实验过程中，应用Matrigel稀释液包被Transwell小室底部膜的上室，并在37 ℃条件下将实验样品自然风干，其余操作同细胞迁移实验。比较各组细胞迁移和侵袭能力。

1.2.5流式细胞术检测细胞凋亡率 各组细胞转染48 h后收集细胞于流式管，胰蛋白酶消化液处理细胞，低温离心处理后调节细胞密度。采集细胞悬液，按照Annexin-V-FITC细胞凋亡检测试剂盒说明进行操作，检测细胞凋亡率。

1.2.6实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-21-5p表达及FGF18mRNA表达 经细胞RNA沉淀、洗涤、溶解和浓度测定后，分别提取各组转染后CD133+/CD44+细胞总RNA。将RNA逆转录成cDNA，参照说明书进行。取反应液进行荧光定量PCR，参照说明书进行操作。采用相对定量法分别计算目的基因miR-21-5p和FGF18相对于内参照(U6)的相对表达量。

1.2.7Western blotting检测CD133、CD44以及FGF18蛋白表达 待细胞生长至汇合状态(80%)，收集细胞加入裂解缓冲液，离心处理后提取各组CD133+/CD44+细胞总蛋白，用BCA试剂盒测定蛋白浓度。根据不同浓度进行定量，待样本处理完毕后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转膜、室温下脱脂奶粉中置于摇床中封闭。滴加一抗兔抗人CD133、CD44和鼠抗人FGF18，4 ℃过夜，PBS洗涤，然后应用HRP标记的羊抗兔IgG抗体孵育(全程避光)。内参照为GAPDH。显影和定影后，采用Image J系统分析计算蛋白相对含量。

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 miR-21-5p与FGF18靶向关系

通过在线分析软件分析显示，FGF18基因与miR-21-5p序列间存在特异结合区域(图1)，确定FGF18是miR-21-5p的靶基因。这一靶向关联为本文细胞实验奠定理论基础。

图1 FGF18基因与miR-21-5p序列间的特异结合区域

2.2 miR-21-5p调控FGF18表达对结肠癌干细胞增殖的影响

CCK-8检测结果显示，与Blank组和NC组相比，miR-21-5p mimic组CD133+/CD44+细胞增殖抑制率明显降低(F=16.28，P<0.05)，miR-21-5p inhibitor组和si-FGF18组明显升高(F=26.53、23.96，P均<0.05)，si-FGF18+miR-21-5p mimic组无明显差异(P>0.05)。而与si-FGF18组相比，si-FGF18+miR-21-5p mimic组CD133+/CD44+细胞增殖抑制率下降，差异有显著性(t=6.181，P<0.05)。见表1。

2.3 miR-21-5p调控FGF18表达对结肠癌干细胞迁移和侵袭影响

Transwell实验结果显示，与Blank组和NC组相比，miR-21-5p mimic组CD133+/CD44+细胞迁移和侵袭能力显著升高；miR-21-5p inhibitor组和si-FGF18组细胞迁移和侵袭能力显著降低，差异具有统计学意义(F迁移=11.23～19.55，F侵袭=21.68～52.85，P均<0.05)；si-FGF18+miR-21-5p mimic组细胞迁移和侵袭能力无明显差异(P均>0.05)。而与si-FGF18组细胞相比，si-FGF18+miR-21-5p mimic组细胞迁移和侵袭能力明显上升(t=4.927、8.073，P均<0.05)。见图2。

a：细胞迁移率柱状图；b：细胞侵袭率柱状图；c：细胞侵袭能力实验检测。A：Blank组，B：NC组，C：miR-21-5p mimic组，D：miR-21-5p inhibitor组，E：si-FGF18组，F：si-FGF18+miR-21-5p mimic组。与Blank组和NC组相比，*P <0.05；与si-FGF18组相比，#P <0.05。

2.4 miR-21-5p调控FGF18表达对结肠癌干细胞凋亡的影响

流式细胞术检测结果显示，与Blank组和NC组相比，miR-21-5p mimic组CD133+/CD44+细胞早、晚期凋亡率呈下降趋势；而miR-21-5p inhibitor组和si-FGF18组凋亡率则上升(F早期=17.22～35.88，F晚期=24.12～109.80，P均<0.05)；si-FGF18+miR-21-5p mimic组凋亡率差异无显著性(P均>0.05)。而与si-FGF18组相比，si-FGF18+miR-21-5p mimic组CD133+/CD44+细胞早、晚期凋亡下降(t=10.73、13.47，P均<0.05)。见表1。

2.5 miR-21-5p调控FGF18表达对miR-21-5p和FGF18相对表达影响

qRT-PCR检测结果显示，与Blank组和NC组相比，miR-21-5p mimic组FGF18mRNA和miR-21-5p的表达水平均显著上升，miR-21-5p inhibitor组FGF18mRNA和miR-21-5p表达水平均显著下调(FFGF18=29.44、886.10，FmiR-21-5p=12.18、764.70，P均<0.05)；si-FGF18组miR-21-5p表达差异无显著性(P>0.05)，而FGF18mRNA表达水平显著下降(F=32.90，P<0.05)；且si-FGF18+miR-21-5p mimic组miR-21-5p表达水平显著上升(F=509.10，P<0.05)，而FGF18表达无显著差异(P>0.05)。见表1。

表1 miR-21-5p调控FGF18表达对结肠癌干细胞生物学行为及两者mRNA表达影响

2.6 miR-21-5p调控FGF18表达对CD44、CD133和FGF18蛋白表达影响

Western blotting结果显示，与Blank组和NC组细胞相比较，miR-21-5p mimic组CD44、CD133和FGF18蛋白表达水平均显著上升(F=109.00～551.90，P均<0.05)；miR-21-5p inhibitor组和si-FGF18组的蛋白表达水平则显著下降(F=9.31～36.45，P均<0.05)，si-FGF18+miR-21-5p mimic组的蛋白表达水平无明显变化(P均>0.05)。与si-FGF18组相比，si-FGF18+miR-21-5p mimic组CD44、CD133和FGF18表达均呈上升趋势(t=3.253～10.18，P均<0.05)。见图3。

a：CD44、CD133和FGF18蛋白表达电泳图；b：CD44、CD133和FGF18蛋白表达水平柱状图。A：Blank组，B：NC组，C：miR-21-5p mimic组，D：miR-21-5p inhibitor组，E：si-FGF18组，F：si-FGF18+miR-21-5p mimic组。与Blank组和NC组相比(n=3)，*P<0.05；与si-FGF18组相比，#P<0.05。

3 讨 论

本研究首先通过生物学预测软件确定FGF18是miR-21-5p的靶基因。进而采用细胞培养并构建质粒转染方法，探究miR-21-5p调控FGF18表达对结肠癌肿瘤干细胞生物学行为的影响。本研究选用流式细胞分选技术筛选CD133+/CD44+结肠癌干细胞的临床意义在于，上皮来源的恶性肿瘤的发生可能与肿瘤干细胞的增殖、分化等潜能存在关联性[10]。针对肿瘤细胞的恶性特征，既往众多研究已发现肿瘤的进程可归因于肿瘤干细胞的特征，如其可自我更新、增殖分裂等，从而导致肿瘤细胞的耐药性、治疗失败、癌症复发等不良后果。肿瘤治疗多采用外源性干预手段抑制此类干细胞的自我更新，从而阻断细胞增殖、诱导细胞凋亡，最终实现逆转肿瘤细胞增殖分化、转移等[11]。作为肿瘤细胞的标志物，CD133、CD44已被证实在肝癌、骨肉瘤等中呈显著高表达，其表达上调可能与激活下游信号通路、抑制肿瘤细胞凋亡等相关联[12-13]。另外，miR-21-5p已被报道与人类消化道癌症等密切相关[14-15]，并通过作用众多的基因靶点参与肿瘤进展，为肿瘤靶向治疗提供新途径。WU等[16]研究显示，miR-21-5p高表达可通过抑制PTEN、激活P13K/Akt信号通路、诱导上皮间质转化等机制促进食管癌发生进程。因此，作者推测miR-21-5p有可能通过特定靶基因，干预结肠癌干细胞生物学进程。FGF18作为成纤维细胞因子，属于纤维细胞因子(FGF)家族，是典型的促癌基因。FGF家族成员在血管生成、组织细胞增殖、成纤维细胞增生等方面发挥重要作用，通过翻译转录可发挥多种潜在功能[17]。FGF18在癌症中呈高表达，如在卵巢高级浆膜癌中呈显著高表达，促进癌症进展[18]。

本研究结果表明，下调miR-21-5p表达和沉默FGF18表达后CD133+/CD44+细胞增殖抑制率和凋亡率显著提升，而迁移和侵袭能力显著降低；而上调miR-21-5p表达结果与此相反；且在上调miR-21-5p表达基础上沉默FGF18表达，逆转了沉默FGF18表达对细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力的作用。本文结果提示，miR-21-5p低表达可在结肠癌干细胞增殖、迁移和转移中发挥正向作用；同时，下调miR-21-5p表达可抑制FGF18表达，进一步凸显了对结肠癌干细胞生物学行为的调控作用。此外，上调miR-21-5p表达后导致FGF18、CD133、CD44蛋白表达水平显著上升；而下调miR-21-5p表达，靶向抑制FGF18，上述因子的表达水平均显著逆转。就其机制而言，微小RNA通常通过靶基因调节转录后表达。我们推测其可能与FGF18为miR-21-5p靶基因，miR-21-5p通过与其3′端非翻译区特异性结合，抑制作为促癌基因FGF18的表达水平，从而达到抑制肿瘤细胞增殖、促进细胞凋亡的结果。LU等[19]报道，过表达miR-21-5p可靶向15-PGDH，促进胆管癌生长。YAN等[20]亦在其研究中通过基因组微阵列数据和靶向预测miR-21-5p可靶向PIK3R1，抑制肿瘤细胞迁移和侵袭，降低PI3K/AKT信号转导并逆转上皮间质转化，在乳癌中发挥重要作用。本研究亦通过类似机制性探讨，初步显示miR-21-5p与其靶基因FGF18在结肠癌肿瘤干细胞中的作用，为临床探究结肠癌治疗提供了一定的实验依据。

综上所述，本研究证实抑制miR-21-5p表达并沉默FGF18表达，可抑制结肠癌肿瘤干细胞增殖、迁移和侵袭，并促进细胞凋亡。本实验为靶向miR-21-5p和FGF18的分子治疗策略提供了实验基础。同时，本研究有待进一步的动物移植瘤实验验证，并佐以进一步的实验探究抑制miR-21-5p表达对肿瘤细胞药物敏感性以及临床病人预后方面的影响。