温新丽,贺玉伟,薛晓梅,吴欣,贾兆通

(青岛大学,山东 青岛 266003 1 附属医院内分泌与代谢性疾病科；2 附属医院山东省代谢性疾病重点实验室；3 代谢病研究院)

近年来痛风已经成为继糖尿病之后的第二大代谢系统疾病[1]。相关调查数据显示，痛风病人已超过8 000万人，而且病人人数以9.7%的年增长率增加[2]。痛风的病理特征是尿酸盐结晶沉积在关节和组织中，进而触发免疫细胞引发炎症反应[3]。其主要危险因素是高尿酸血症，即血清尿酸盐水平升高。对于大多数痛风病人来说，排泄不足是高尿酸血症的主要原因[4]。痛风如得不到及时有效的治疗可能累及肾脏，导致痛风性肾病，严重者出现肾功能不全等[5]。目前西医治疗可产生诸多副作用，如胃肠道反应、皮疹、肝肾功能损伤等。此外，此类药物不能预防、阻止或逆转痛风的进程。中药复方和从中草药分离出的某些化合物已被用于治疗痛风，效果令人满意[6]，并且不良反应低于西药[7]。痛风汤是以土茯苓、萆薢、苍术、生薏苡仁、威灵仙、蚕沙、地龙、泽泻、桃仁、红花组合形成基础方，病人合并不同痛风症状时加减不同药材以控制症状[8]。痛风汤治疗痛风效果良好，无显著毒副作用，复发率低[9]。目前尚无系统研究痛风汤物质基础及其治疗痛风机制的报道。本研究通过网络药理学方法揭示痛风汤活性成分和关键靶点，以探讨其治疗痛风的机制。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 痛风汤活性成分和对应靶点的获取

分别以“威灵仙”、“苍术”、“薏苡仁”、“泽泻”、“桃仁”、“红花”、“土茯苓”、“粉萆薢”、“蚕沙”为关键词，在中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP，http://sm.nwsuaf.edu.cn/lsp/tcmsp.php)[10]中，检索获得其化学成分；在检索结果中限定口服生物利用度(OB)≥30%和类药性(DL)≥0.18为条件进行筛选。同时在中国中药整合数据库(TCMID，http://www.megabionet.org/tcmid)[11]平台中以“地龙”为关键词，检索获得其化学成分“蚯蚓素”。“蚯蚓素”的相应靶点通过Similarity Ensemble Approach数据库(SEA，http://sea.bkslab.org)[12]进行预测。使用Cytoscape 3.7.1软件构建痛风汤的“药材-成分-靶点”网络。

1.2 痛风相关靶点基因的获取

在人类基因组注释数据库(Genecards，https://www.genecards.org)中以“gout”为关键词检索与痛风相关的靶点基因。

1.3 蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络

所有的PPI网络数据均来自STRING数据库(https://string-db.org)的分析结果。首先将数据导入Cytoscape 3.7.1软件绘制PPI网络，构建痛风汤靶点之间的PPI网络、痛风相关靶点之间的PPI网络、痛风汤和痛风共同涉及的关键通路的PPI网络。然后用SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch)预测痛风汤某些成分的真实靶点。

1.4 KEGG信号通路富集分析

将痛风汤靶点和痛风相关靶点的基因名导入DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)[13]进行KEGG信号通路富集分析，保存结果。选取满足FDR<0.05的通路，并根据 FDR值的大小绘制气泡图。

1.5 分子对接

应用SwissDock(http://www.swissdock.ch)将FLT3(PDB ID:4rt7)、MAOA(PDB ID:2Z5X)分别与槲皮素、木犀草素进行分子对接；选取NOS2(PDB ID:4NOS)、PTGS2(PDB ID:5ikq)与汉黄芩素进行分子对接。对接结果通过PyMOL 1.7.0(美国Schrödinger,LLC)展示。

2 结 果

2.1 痛风汤“药材-成分-靶点”网络

共从痛风汤10味药材中筛选出痛风汤活性成分82个，活性成分对应的靶点244个。通过Cytoscape 3.7.1软件构建的痛风汤“药材-成分-靶点”网络见图1。

绿色节点()代表痛风汤的10味药材；蓝色节点()代表痛风汤中的活性成分；红色节点()代表痛风汤活性成分对应的靶点。

2.2 痛风汤作用靶点和痛风相关靶点PPI网络

将痛风汤作用靶点导入STRING数据库中，获取其PPI网络的原始数据并保存，使用Cytoscape 3.7.1绘制PPI网络。剔除未与网络连接的3个作用靶点，此网络共包含了241个节点(图2A)。靶点与靶点的连接度越高，重要性越强，颜色越趋向于红色，且靶点的面积较大。因此，痛风汤靶点中连接度最高的5个靶点分别为AKT1、ALB、IL-6、TP53和MAPK-3。对978个痛风相关靶点进行分析，获得了痛风相关靶点的PPI网络(图2B)。该网络减去未结合的180个作用靶点，共包含798个痛风相关靶点基因。痛风相关靶点中连接度最高的5个靶点分别为IL-6、INS、GAPDH、TNF和ALB。

A：痛风汤作用靶点PPI网络；B：痛风相关靶点PPI网络。靶点与靶点的连接度越高，重要性越强，颜色越趋向于红色，且靶点的面积较大。

2.3 痛风汤和痛风涉及的细胞信号通路

通过KEGG通路富集分析找到痛风汤涉及的26个重要信号通路(图3A)和痛风发病涉及的14个细胞信号通路(图3B)。痛风汤靶点通路与痛风发病相关通路相互重叠的共同通路为4个，分别为Pathway in cancer、NOD-like receptor signaling pathway、Toll-like receptor signaling pathway和T cell receptor signaling pathway。由于KEGG分析中Pathway in cancer的-Log10FDR值最大，因此Pathway in cancer对于痛风汤治疗痛风的机制是最重要的。

A：痛风汤涉及的26个重要信号通路；B:痛风发病涉及的14个细胞信号通路。

2.4 痛风汤与痛风涉及共同细胞信号通路的PPI网络

从Pathway in cancer、NOD-like receptor signaling pathway、Toll-like receptor signaling pathway和T cell receptor signaling pathway共4个细胞信号通路中找到痛风汤和痛风均涉及的靶点构建PPI网络，找到各PPI网络中的关键靶点(图4)。Cytoscape分析中，靶点颜色越趋向红色，且靶点面积越大，即被认为关键程度越高。因此，Pathway in cancer通路中涉及的排名前5位的最关键靶点分别为TP53、PTGS2、IL6、MAPK1和RELA。

靶点颜色越趋向红色，且靶点面积越大，关键程度越高。

2.5 TP53及其对应药物活性成分真实靶点的PPI网络

痛风汤中对应TP53靶点的活性成分是土茯苓和红花中的槲皮素(Quercetin)、红花中的木犀草素(Luteolin)和苍术中的汉黄芩素(Wogonin)。通过SwissTargetPrediction数据库预测到槲皮素的59个预测靶点、木犀草素的25个预测靶点和汉黄芩素的2个预测靶点。分别利用这些化合物的真实靶点构建了与TP53的PPI网络(图5)，显示出槲皮素、木犀草素、汉黄芩素等痛风汤活性成分调控TP53基因的机制。

A:木犀草素真实靶点与TP53的PPI网络；B:汉黄芩素真实靶点与TP53的PPI网络；C:槲皮素真实靶点与TP53的PPI网络。

2.6 分子对接

选取FLT3、MAOA分别与木犀草素、槲皮素进行分子对接，选取NOS2、PTGS2与汉黄芩素进行了分子对接，揭示了痛风汤的特定活性成分与其靶点的结合模式(图6)。

图6 分子对接结果

3 讨 论

痛风的临床特点为高尿酸血症及其引发的急性炎症[14]。中医学认为高尿酸血症是因湿浊、热毒、血瘀、痰凝所致，需以祛湿通络、泄浊解毒为治疗原则[15]。国医大师朱良春认为湿浊瘀滞内阻，才是痛风发病的主要原因，并将其命名为“浊瘀痹”[16]。痛风汤是治疗“浊瘀痹”的专病专方。因此有必要深入研究其组方规律和作用机制。

痛风汤的基础方(土茯苓、萆薢、苍术、生薏苡仁、威灵仙、蚕沙、地龙、泽泻、桃仁、红花)可促进浊毒泄化、瘀结解除。在此基础上可加入其他药材，做到辨证论治，个体化给药[8]。由于中药复方具有药效的整体性和成分的复杂性，揭示复方中有效成分与靶点、信号途径之间的关系，是研究中药复方的关键[17]。同样，深入理解痛风汤治疗痛风的作用需要一种揭示成分-靶点-通路关系的系统生物学方法。中药复方的药理作用可能是由于多种成分作用于多个靶点，进而调控多个细胞信号途径的过程。系统生物学中网络药理学也许能解决中药作用机制复杂性的问题。网络药理学研究的目的不是确定单个候选化合物，而是全面分析复杂体系，构建复杂成分与其药理学作用之间的网络[18]，其整体和系统特征与中药发挥作用的原理一致。

本研究中KEGG分析结果显示，痛风汤的药理作用涉及27个信号通路，而与痛风发病相关的关键通路共有14个。痛风汤药理作用与痛风发病相关通路均涉及的共同通路为4个，分别为Pathway in cancer、NOD-like receptor signaling pathway、Toll-like receptor signaling pathway和T cell receptor signaling pathway。这样的思路与大部分中药复方网络药理学研究不同。细胞信号通路包含了多种靶点，而且每个靶点被不同的化合物所影响。但是，每个信号通路所代表的生物学效应是固定的，这样的生物学效应不会因为不同化合物靶向于通路中不同的靶点而发生改变。因此，不同化合物作用于不同的蛋白靶点时，很可能具有相同的生物学效应。只要这些蛋白靶点涉及同一信号通路即可。因此，在网络药理学研究过程中，可以预先忽略中药复方的靶点与疾病相关靶点中共同靶点，分别寻找相关靶信号通路，进而得到共同信号通路。这可能是中药复方网络药理学研究方法的改进。

本文研究结果还显示，痛风汤涉及的最重要通路是Pathways in cancer，其中TP53为关键靶点。可影响TP53的化合物分别是土茯苓和红花中的槲皮素、红花中的木犀草素、苍术中的汉黄芩素。槲皮素是日常饮食中含量最丰富的类黄酮之一，它可抑制黄嘌呤氧化酶(XOD)催化的尿酸和超氧自由基的生成，可以作为预防痛风和过氧化损伤的潜在化合物[19]。木犀草素是芹菜和青椒的主要成分之一，可竞争性地抑制XOD[20]。在高尿酸血症小鼠中，槲皮素与木犀草素的这种作用有助于增强尿酸排泄并改善高尿酸血症引起的肾功能不全。此外，还有研究显示，木犀草素和木犀草素-4’-O-葡萄糖苷还可减轻单钠尿酸盐晶体引起的小鼠足肿胀和炎症，其机制可能与它们降低IL-1β和TNF-α的水平有关[21]。汉黄芩素对XOD也有较强的抑制作用[22]，其IC50=157.38 μmol/L[23]。因此有研究指出，汉黄芩素可能是治疗痛风性关节炎的潜在化合物[24]。

该研究也存在一些网络药理学研究存在的共性问题。例如本研究中使用的痛风汤活性成分来自TCMSP数据库，筛选标准则是根据化合物的OB和DL的大小来决定是否候选为活性成分。但是本研究中动物药材地龙的唯一候选成分蚯蚓素，来自TCMID数据库，没有按照OB和DL的标准来筛选。因此，在今后的研究中需要统一筛选标准，且需要更多来自地龙的候选成分。另外在研究过程中还发现，许多文献报道的活性化合物未达到数据库的OB和DL大小标准而被从活性成分的列表中剔除。在今后的研究中需要对这部分化合物进行重新评价，纳入活性成分列表进行深入发掘。未来在解决以上共性问题的基础上，需要在细胞水平验证活性成分-靶点、成分-通路的关系，这样才能验证网络药理学预测结果的准确性，这对于阐明痛风汤作用机制、筛选其中的活性成分具有重要意义。