杨茜,郑宪鑫,朱亮,唐锡龙,李永红

(青岛大学,山东 青岛 266100 1 附属医院心内科；2 基础医学院；3 附属医院急诊内科)

心血管病是全球发病率和死亡率最高的疾病之一。动脉粥样硬化被认为是心血管疾病的主要病理学基础[1]。血管平滑肌细胞(VSMCs)的死亡参与了动脉粥样硬化的病理生理过程[2]。铁死亡是细胞死亡的一种形式，以细胞内铁依赖性和脂质活性氧(ROS)的积累为特征[3]。多种化学和生物因素都能诱导细胞铁死亡。erastin是一种能够选择性杀死表达小T癌蛋白和大鼠肉瘤蛋白的工程肿瘤细胞小分子化合物，也是一种高效的铁死亡诱导剂[4]。花生四烯酸15-脂氧合酶 (ALOX15)是一种酶,参与了早期的炎症反应[5]。研究表明，ALOX15诱导VSMCs在调节血管张力和血管壁重塑中发挥重要作用[6]。然而，ALOX15能否参与调控VSMC的铁死亡途径尚未明确。本研究旨在探讨ALOX15对VSMCs铁死亡的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂

人主动脉VSMCs购自美国ATCC公司;DMEM高糖培养基、磷酸缓冲盐溶液(PBS)缓冲液、胰酶、40 g/L多聚甲醛-通用型组织固定液购自大连美仑生物技术有限公司;胎牛血清(FBS)购自中国吉泰依科赛公司;ALOX15过表达质粒购自于上海吉玛制药技术有限公司;erastin购自于美国Abmole公司;Lipfectamine 3000购自赛默飞世尔科技公司；RIPA裂解液(高强度)、BCA蛋白浓度检测试剂盒、Hoechst 33342/PI双染试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司;PAGE凝胶试剂盒购于上海雅酶生物科技有限公司;ALOX15抗体购自santa cruz生物技术有限公司,β-actin抗体及羊抗兔二抗和羊抗鼠二抗购自affinity公司;ECL化学发光试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1细胞培养与处理 复苏VSMCs后，加入含体积分数0.10 FBS、100 mg/L青霉素-链霉素的DMEM高糖培养基中，于含体积分数0.05 CO2、37 ℃的恒温培养箱中培养，细胞汇合度达90%时传代。

1.2.2Western blot检测ALOX15蛋白表达水平在6孔板中培养VSMCs，当细胞汇合度达到70%左右时，将其分为对照组(A组，未处理)、空载组(B组，转染质粒Empty Vector)、ALOX15组(C组，转染质粒ALOX15)，转染24 h后，弃掉培养基，PBS洗3次，加入细胞裂解液并提取蛋白质，BCA法测定蛋白浓度。取等质量蛋白样品，在蛋白中加入适量的上样缓冲液，在98 ℃金属浴中加热10 min。采用PAGE凝胶制备试剂盒制胶，每孔取30 μg蛋白进行上样。80 V恒压电泳2.5 h，恒流(250 mA)转膜1 h，将膜放置于质量浓度为50 g/L脱脂奶粉封闭液中摇床孵育1 h。TBST洗涤(10 min，3次)，加入β-actin(1∶2 000)、ALOX15一抗(1∶2 000)，4 ℃过夜孵育。TBST洗涤(10 min，3次)后加二抗(1∶5 000)室温孵育1 h。TBST洗涤(10 min，3次)后，加入ECL化学发光液，通过Fusion Solos化学发光成像系统扫描蛋白条带，使用Image J软件处理图像,分析ALOX15蛋白的相对表达水平。

1.2.3PI染色检测VSMCs死亡率 在24孔板中培养VSMCs，当细胞汇合度达到70%左右时，分为对照组(未处理)、erastin组(加erastin)、Empty Vector+erastin组(转染Empty Vector 12 h后加erastin)和质粒ALOX15+erastin组(转染质粒ALOX15 12 h后加erastin)。使用Lipofectamine 3000转染质粒ALOX15及Empty Vector，根据说明书的要求操作。各组处理完后继续培养24 h。将24孔板置于冰上，弃掉培养基，PBS洗3次，用细胞固定液对细胞进行固定，30 min后弃掉细胞固定液，PBS洗3次，使用Hoechst 33342/PI双染试剂盒检测VSMCs死亡率，根据说明书的要求操作。最后于荧光显微镜下观察细胞死亡情况。

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 各组ALOX15蛋白表达的比较

Western blot检测结果显示，对照组、空载组、ALOX15组的ALOX15蛋白表达分别为0.26±0.03、0.20±0.02和1.09±0.06，与对照组和空载组比较，ALOX15组的ALOX15蛋白表达明显升高，差异有统计学意义(F=425.2,P<0.01)。转染质粒ALOX15明显上调了VSMCs中ALOX15的表达。见图1。

A：对照组，B：空载组，C：ALOX15组。

2.2 过表达ALOX15对细胞死亡的影响

PI染色的结果显示，对照组、erastin组、Empty Vector+erastin组和质粒ALOX15+erastin组细胞死亡率分别为(0.60±0.36)%、(9.29±0.16)%、(9.79±0.59)%和(21.41±2.42)%，各组之间比较差异有显著意义(F=138.1,P<0.01)。其中质粒ALOX15+erastin组细胞死亡率明显高于其他3组，差异有显著性(t=8.098～14.760，P<0.01)。

3 讨 论

伴随着我国人民生活水平的明显提高、城镇化进程的加速以及人口老龄化，心血管疾病的发病人数持续增加，其中以动脉粥样硬化为基础病变的脑卒中和冠心病死亡率居高不下，远远超过了肿瘤及其他疾病。动脉粥样硬化斑块进展过程中，VSMCs等细胞的死亡发挥着重要作用[2]。包括动脉粥样硬化等多种疾病的病理生理过程涉及VSMCs的死亡[1]。因此，阐明VSMCs死亡的分子机制对改善血管疾病的治疗有重要意义，有助于寻找新的治疗靶点。尽管一些细胞死亡类型如细胞凋亡、焦亡和自噬已被阐明和VSMCs功能相关[7],但VSMCs铁死亡作用尚未明确。

本研究为了探讨ALOX15对VSMCs铁死亡的影响，首先构建了erastin诱导VSMCs铁死亡的细胞模型。erastin是一种铁死亡诱导剂，能够对癌细胞产生致命性损伤，这一功能是通过作用于线粒体电压依赖性阴离子通道来发挥的[8]。在HT1080细胞中，erastin诱导的细胞死亡引发了细胞ROS的累积，而且其诱导的氧化性死亡是铁依赖性的。此外，非依赖性胱氨酸/谷氨酸逆向转运体系统的活性也能够被erastin所抑制[9]。将VSMCs暴露于erastin后可触发其铁死亡。因此，应用erastin诱导VSMCs铁死亡是一种理想VSMCs铁死亡模型。

在多种组织和肿瘤表达的脂氧合酶(LOXs)是一种非血红素铁双加氧酶。癌细胞会积聚铁，而铁蛋白受体介导的细胞外途径和铁蛋白吞噬所涉及的细胞内途径提供的铁对于促进细胞铁死亡至关重要[10-12]。铁可能直接催化脂质自由基的形成和参与脂质过氧化的传播，但是由LOXs催化的脂质氧化途径产生的氧化多不饱和脂肪酸可以导致细胞死亡[13]。ALOX15为LOXs家族成员[5,14]，既往研究关注于ALOX15参与VSMCs的炎症、增殖和迁移作用，但是ALOX15是否参与调控VSMCs中的铁死亡尚不清楚。本研究Western blot结果显示，与对照组组和空载组比较，ALOX15组的ALOX15蛋白表达明显升高，这表明在转染质粒ALOX15后VSMCs中的ALOX15表达明显升高。为了进一步验证ALOX15是否也参与调控VSMCs的铁死亡，本研究应用PI染色检测VSMCs死亡率。结果显示，与对照组、erastin组、Empty Vector+erastin组相比较，质粒ALOX15+erastin组细胞死亡率明显增加，表明ALOX15明显促进了erastin诱导的VSMCs死亡。推测ALOX15可能参与了erastin诱导下的细胞死亡。但有关铁死亡与VSMCs关系的具体机制仍需要进一步阐明。

总之，VSMCs转染质粒ALOX15后ALOX15蛋白表达升高，进一步转染质粒ALOX15可以促进erastin诱导的VSMCs的死亡，但其作用具体分子机制还需要进一步深入研究。