陈阳,冉雯雯,王璐,宋瑶琳,李广起,邢晓明

(青岛大学,山东 青岛 266071 1 基础医学院病理学系；2 附属医院病理科)

结直肠癌(CRC)是胃肠道常见的恶性肿瘤之一，是全球范围内的第四大恶性肿瘤[1]。CRC起病隐匿，侵袭转移能力强，晚期转移是多数病人死亡的主要原因，但其转移的分子机制目前尚不明确[2]。G蛋白信号调节蛋白1(GPSM1)为G蛋白信号激活蛋白家族Ⅱ(AGSⅡ)的成员，是1999年由英国科学家在对酵母进行遗传学筛查时发现的一种蛋白质，该蛋白由N末端的7个四肽重复序列(TPR)和C末端的4个G蛋白调节模体(GPR)组成[3-4]。GPSM1在神经组织、睾丸组织中广泛分布，作为鸟嘌呤核苷酸解离抑制剂参与G蛋白信号通路的调节，以及神经元分化和纺锤体形成等多种生物学进程[3-8]。近年来研究显示，GPSM1在人食管鳞状细胞癌、前列腺癌组织中异常表达并影响肿瘤细胞的增殖、转移及凋亡[9-10]。GPSM1也参与CRC细胞系HT29巨自噬的早期调控[11]，但GPSM1在CRC中的表达及作用尚不明确。大鼠肉瘤病毒(RAS)基因突变是癌症最易发生的突变之一，约42%的CRC病人伴RAS基因突变[12]。RAS基因属于原癌基因家族，编码KRAS、NRAS和HRAS，其中KRAS突变率最高(约占85%)[13]。RAS基因突变可使细胞信号传导异常激活，持续传递有丝分裂信号，诱导细胞增殖分化，促进肿瘤发生[14]。美国肿瘤联合会(AJCC)第8版癌症分期系统明确指出，KRAS和NRAS是影响CRC预后的关键因素[15]。本研究旨在通过检测GPSM1在CRC组织中的表达，探讨GPSM1表达与KRAS、NRAS突变及病人临床病理特征的相关性，以期为CRC防治提供新的分子标志物及治疗靶点。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2015年4月—2016年4月青岛大学附属医院收治的150例CRC病人的石蜡组织样本及临床病理资料，临床病理资料包括病人性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、分化程度、TNM分期、浸润深度、淋巴结转移、KRAS和NRAS突变情况等。所有病人均为原发性CRC，术前未行放化疗和靶向治疗。对150例CRC病人定期进行电话和门诊随访，随访截止日期为2020年3月。150例病人均有完整的随访资料，其中52例病人死亡，9例病人发生了术后转移复发。本研究经青岛大学附属医院伦理委员会批准。

1.2 实验方法

1.2.1组织芯片制备 由两名病理医师对所有蜡块进行复片，光学显微镜下选取典型区域并标记，使用Pathology Devices TMAjrTM组织芯片点样仪制作孔径为2.0 mm的组织芯片，4 μm切片。

1.2.2GPSM1免疫组织化学检测 采用PV-6000法进行免疫组织化学染色。组织芯片经脱蜡、水化后，使用体积分数0.03的过氧化氢灭活内源性过氧化物酶10 min，高压修复2 min(枸橼酸盐pH值6.0)；滴加GPSM1一抗(1∶200，NBP1-91968，NOVUS，美国)，以PBS代替一抗作为阴性对照，4 ℃孵育过夜；滴加通用型二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)，37 ℃孵育30 min；DAB显色3 min，使用苏木精复染，脱水、封片。

每张切片由两名资深病理医师随机选择5个高倍视野，判读GPSM1染色结果。GPSM1阳性染色定位于细胞浆。根据染色强度及阳性细胞率进行半定量评分。染色强度评分：无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；阳性细胞率评分：≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51～75%为3分，>75%为4分。两项评分相乘，≥4分为高表达，<4分为低表达[16]。

1.2.3KRAS及NRAS基因突变的检测 使用石蜡包埋组织DNA提取试剂盒(TIANGEN公司，DP331-02，中国)提取150例CRC石蜡组织切片中的DNA，然后应用KRAS、NRAS突变检测试剂盒(上海源奇生物制药有限公司)检测其突变情况。使用ABI7500实时荧光定量PCR系统(Thermo Fisher Scientific Inc，美国)进行扩增。KRAS基因突变扩增程序为：42 ℃、5 min；94 ℃、3 min；94 ℃、15 s，60 ℃、60 s；共40个循环；于60 ℃下采集荧光信号。NRAS基因突变扩增程序为：42 ℃、5 min；94 ℃、3 min；94 ℃、45 s，60 ℃、80 s；共40个循环；于60 ℃下采集荧光信号。

1.3 统计学分析

使用SPSS 23.0软件对数据进行统计学处理。GPSM1表达与KRAS、NRAS突变及临床病理特征的关系分析采用Pearsonχ2检验；GPSM1表达与病人术后生存时间的关系分析采用Kaplan-Meier生存分析和Log rank检验，生存曲线的绘制采用GraphPad Prism 7软件。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 GPSM1在CRC组织中的表达

免疫组织化学检测结果显示，GPSM1在CRC组织细胞浆中呈高表达，在癌旁组织细胞浆呈低表达或不表达(图1)。在CRC组织中，108例呈高表达，42例呈低表达；在癌旁组织中，21例呈高表达，129例呈低表达。GPSM1在CRC组织与癌旁组织中的表达差异具有统计学意义(χ2=102.938,P<0.001)。

A：GPSM1在癌旁组织中呈阴性表达；B：GPSM1在CRC组织中呈高表达。免疫组织化学染色。

2.2 KRAS及NRAS基因突变情况

实时荧光定量PCR检测结果显示，CRC组织KRAS及NRAS突变率分别为44.00%(66/150)和3.33%(5/150)。

2.3 GPSM1表达水平与CRC病人临床病理特征的关系

GPSM1在CRC组织中的高表达与淋巴结转移(χ2=5.429，P=0.020)以及KRAS突变(χ2=4.030，P=0.045)相关，而与性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、分化程度、TNM分期、浸润深度、远处转移、NRAS突变等均无相关性(P>0.05)。见表1。

表1 GPSM1表达与CRC病人临床病理特征的关系(例(χ/%)

2.4 GPSM1表达与CRC病人预后的关系

根据GPSM1在CRC组织中的表达水平将CRC病人分为GPSM1高表达和低表达组，Kaplan Meier生存分析显示，GPSM1高表达组(n=108)CRC病人的无病和总体生存期较GPSM1低表达组(n=42)明显缩短(P=0.046、0.036)。见图2。

A：不同GPSM1表达水平病人无病生存曲线；B：不同GPSM1表达水平病人总体生存曲线。

3 讨 论

GPSM1是调节G蛋白信号转导系统的重要蛋白之一，生理状态下其主要作用是介导G蛋白信号转导通路的调控，参与神经元分化以及纺锤体形成[3-5]。近年的研究发现，GPSM1在多种肿瘤组织中异常表达，包括人食管鳞状细胞癌、胃癌、前列腺癌等，并且与肿瘤恶性程度及细胞增殖和侵袭性相关[9-10,17]。但GPSM1在CRC组织中的表达及意义尚缺乏相关研究。本研究通过免疫组织化学染色检测显示，GPSM1在CRC组织中的表达水平较其在癌旁组织明显升高，且是CRC病人预后不良的指标，提示GPSM1可能参与了CRC的发生发展。

目前研究表明，GPSM1与多种肿瘤的发生密切相关。SHI等[9]研究显示，食管鳞状细胞癌组织中GPSM1的低表达状态与肿瘤的分级呈正相关，GPSM1高表达的病人生存时间更长，GPSM1是食管鳞状细胞癌病人独立的预后因素；并且过表达GPSM1能够明显抑制食管鳞状细胞癌细胞的增殖。ZHANG等[17]研究证实，GPSM1的DNA甲基化可能参与胃癌的侵袭和转移，并且与癌症病人的预后显著相关。ADEKOYA等[10]的研究结果表明，GPSM1在前列腺癌中表达水平明显增高，前列腺癌细胞中过表达GPSM1可促进体内、体外肿瘤细胞的增殖。本研究对CRC组织中GPSM1表达与病人临床病理特征的相关性进行分析，结果显示，CRC组织高表达GPSM1的病人更容易发生淋巴结转移，而GPSM1表达与病人年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤分化程度等均无关。进一步分析GPSM1表达与CRC病人预后关系显示，GPSM1高表达病人预后较差，提示GPSM1可能参与了CRC的侵袭转移，是CRC预后不良的预测指标。

目前，GPSM1在CRC中作用的分子机制及相关信号转导通路尚未阐明。研究表明，Notch信号通路参与了CRC的上皮间质转化过程并调控肿瘤干细胞的形成，可促进CRC转移以及肿瘤形成[18]。Wnt/β-catenin信号通路在肠隐窝底部激活、结直肠稳态维持及肿瘤形成过程中均发挥至关重要的作用[19]。另外，核因子κB(NF-κB)、表皮生长因子受体(EGFR)、RAS等信号通路在调控CRC细胞凋亡、增殖、转移方面均发挥重要作用[20-22]。

KRAS突变是常见的致癌性突变，以12、13位密码子突变最为多见。突变型KRAS能够摆脱上游信号分子EGFR的调控，促进RAS-RAF-MEF-ERK信号通路的激活，增强肿瘤细胞对机体的适应性，促进肿瘤发生发展[23-24]。多项研究结果显示，KRAS突变与CRC转移显著相关，是CRC转移的潜在生物标志物[25-26]。本研究结果显示，CRC组织中GPSM1表达水平与KRAS突变显著相关。表明GPSM1可能与KRAS协同作用，促进CRC的发生与演进，或可作为临床检测CRC转移的补充指标。KRAS突变可影响下游信号通路传导，使肿瘤细胞对西妥昔单抗产生耐药，且KRAS与GPSM1均可调控鸟嘌呤核苷酸的水解与结合，二者在功能上具有相似性[27-29]。这提示GPSM1可能与KRAS一同在西妥昔单抗的耐药机制中发挥作用，或可成为西妥昔单抗耐药的潜在指标。

综上所述，GPSM1在CRC中呈高表达状态，与CRC病人淋巴结转移及KRAS突变存在相关性，并与不良预后相关，可作为CRC诊断、治疗及预后判断的潜在指标。