宋健

(沈阳市食品药品检验所理化检验室，沈阳 110136)

0 引言

明胶为水溶性蛋白质高分子多肽高聚物，是由不同动物中的胶原经部分水解而获取[1]，营养价值高，广泛用于食品、医药等领域。明胶作为一种亲水性保护胶体，乳化作用强[2]，能够有效抑制乳制品等高蛋白食品因胃酸而产生的凝聚反应，从而快速促进乳制品等食品的消化[3]。然而工业明胶与食品级明胶不同，其危害人体健康。工业明胶在制造过程中产生大量的六价铬和砷等[4]，并且使用五氯苯酚作为防腐剂，因此国家禁止将工业明胶添加到食品中[5]。目前单纯对于明胶的测定无法区别工业明胶和食品级明胶。针对于工业明胶的检测研究非常少。

目前，我国的食用明胶行业发展迅速，市场应用前景广阔，明胶在乳品中的需求将不断增长。明胶在不断增长的市场需求刺激下，乳制品生产商不得不在配方中使用多种成分明胶产品[6-8]，使其满足需求。市场的迅速发展以及利益驱使下，明胶掺假现象时有发生，因此需要加强乳制品明胶检测的监督与管理。本研究在分析明胶和乳制品特性的基础上，研究不同明胶检测方法的应用特性，为乳制品中明胶的检验提供有利依据。

1 明胶在乳制品行业的应用

明胶是一种大分子亲水性蛋白质混合物，使用过程中能够达到起泡和稳泡的效果[9]。明胶因特殊的凝胶网状结构在乳制品生产过程中起到多种功能。明胶通过氢键作用[10]阻止乳清析出，避免酪蛋白的收缩反应，阻止固相从液相中产生分离；明胶可以为酪蛋白提供稳定的环境，防止酪蛋白在酸性环境下中会失去乳化能力[11]；明胶与水结合形成明胶薄层覆盖脂肪球[12]，包裹空气气泡，从而保持稳定的乳化状态。

明胶可以使低脂酸奶达到类似高奶油含量酸奶的组织状态，在软质干酪生产过程中通过与水结合起到稳定效果，有效阻止乳清的析出[13-15]。由于明胶融点非常接近人体温度，使得明胶产品具有滑润细腻的口感和风味。明胶能够抵抗游离水受热变化所引起的食品变质，从而减缓冰晶的成长[16]，降低温度对冰激凌存储时间的影响，进而减慢冰激凌的融化速度。

2 分析方法

明胶独特的高分子结构特性赋予其多种功能，这些功能使其广泛应用于生活各方各面。明胶的大量应用的同时，加强明胶检测与监管成为一种必然需求[17-19]。目前，各界学者比较认可的明胶检测方法主要包括光学与光谱法[20]、沉淀分离法、液相-色谱法、免疫吸附法。本文对上述方法的特点与局限性进行详细分析，如表1所示。

表1 多种明胶检测方法的比较

2.1 光学分析与光谱技术法

光学分析法是基于明胶中特定物质对光的选择吸收而建立的分析方法，其中包括比色法、紫外分光光度法、红外分光光度法等。

动物明胶中的胶原蛋白经过浓酸的水解作用，分离出其特有的羟脯氨酸，其经过氯胺T的氧化作用，最终转化成含有吡咯环的氧化物[21]。用高氯酸分解过量的氯胺T后，羟脯氨酸氧化物与对二甲氨基苯甲醛相互作用生成红色的化合物，然后利用紫外可见分光光度计测定其吸光值[22]，最后与标准系列定量比较。此方法不需要衍生，简单有效，检测成本低。

分光光度是一种检测明胶中特定物质含量的传统方式，常规的分光光度法要辅助一定的分离手段以提高检验准确度，操作简便，应用较广。原子吸收光谱法是将待测样品气化为基态原子，然后分析特征线谱和线谱被削弱程度的一种方法。在一定检测范围内，吸光度与被测元素浓度成正比。此方法是测定明胶中铬含量的主要方法[23]，可避免分光光度法测定的缺陷。可分为火焰原子吸收法和石墨炉原子吸收法[24]。石墨炉原子吸收法通过微波消解法和超声提取法对样品进行前处理，采用原子吸收分光光度计石墨炉法测定总铬和六价铬含量[25]，有较好的检出限，不受干扰，稳定性能满足检测要求，准确度好，能直接分析固体及较高的溶液试验等优点，但其受干扰较严重，不适合做多元素分析。

太赫兹波谱[26]技术作为一种新型的检测技术近年来得到越来越广泛的应用，由于其特征光谱对很多极性大分子具有较强的吸收特性，更容易检测和鉴别有毒的物品和复杂异物。明胶样品在经过研磨等处理后，采用太赫兹投射式实验后，可以看出食品级明胶和工业明胶存在明显差异[27]，食品级明胶的吸光度随着频率增加而上升，工业明胶吸光度则有着明显的上升后下降的趋势。

2.2 沉淀分离法

沉淀法是利用沉淀反应，将被测明胶的某种特定元素转变成为难容物质，并将其从溶液中分离为沉淀物，测定其重量以完成对被测明胶含量的检测。根据沉淀剂的不同，可分为试剂沉淀法、盐沉淀法以及化学沉淀法。魏战峰、杨水云等借助硝酸汞和苦味酸的分步沉淀法[28]沉淀乳制品的乳蛋白和明胶，从而完成对原料奶中有无明胶的定性检测。为了防止乳制品中乳蛋白沉淀不彻底而导致明胶检测的假阳性，硝酸汞的含量必须严格满足相应的检测要求。苦味酸与明胶相互作用会形成非均相沉淀，形成絮状漂浮物[29]。此种方法可采用试剂盒方式快速检验。Hidaka和Liu等利用明胶能够有效促进烃基磷灰石形成从而强化磷酸钙的形成的特性，从而通过明胶和磷酸钙沉淀的相互反应测定明胶来源[30]。

分步沉淀法检测明胶的敏感度和稳定性都较高，且能够实现快速检测，但由于沉淀法容易受到被测乳制品中其他食品添加剂的干扰，因此会为明胶检测带来一定困难，需要优化沉淀剂和试剂用量，加强检测方法的抗干扰能力。

2.3 液相色谱-质谱法

液相色谱-质谱联用技术以液相色谱法因对被测物结构破坏性小，分离范围广，可作为快速分离系统，质谱法因灵敏度高，结构分析准确度高，可作为检测系统。纯化后的样品在液相色谱法下分离和离子化，经测量仪器得到质谱图。液质联用检测技术体现了色谱和质谱优势的互补，有效利用色谱对复杂样品的高分离能力和质谱的高选择性[31]，在食品检测等领域有普遍的应用。因此色谱-质谱联用成为分析微量有机混合物的有效方法。

明胶作为胶原蛋白的降解物主要由不同分子量的多肽[32]组成。这些多肽可被胰蛋白酶继续降解，降解后的多肽经液相色谱-质谱分析后，比较多肽的氨基酸序列差异，分析特征肽的种类以鉴别明胶。高效液相色谱法对酶分解后的明胶多肽特征识别，根据色谱图峰面积分析比较脯氨酸和羟脯氨酸含量高低，完成对明胶含量的检测，检测流程如图1所示。刘琳等通过纤维连接蛋白（FN）能够与明胶多肽反应结合的性质[33-34]，采用亲和层析法分离出牛乳中的明胶多肽[35]，依据明胶多肽蛋白质的分布特性，利用亲和介质分离法[36]，通过比较多肽质谱[37]的峰强度高低判别被测物质是否为明胶多肽。液相色谱-质谱检测技术作为分析多肽组成、结构和功能重要方法之一，在结合蛋白质酶切技术的基础上，能够较为有效鉴别明胶，但检测样品前处理和分析手段较复杂，存在一定的改进空间。

图1 液相色谱-质谱法明胶的检测流程

M.T.Y.Yilmaz改进了HPLC-MS/MS法应用了超高效液相色谱串联电喷雾电离-四极杆飞行时间质谱(nanoUPLC-ESI-q-TOF-MSE)方法通过检测明胶中的标记肽以鉴别乳制品中的明胶来源[38]。在测试了猪明胶和牛明胶对应的独特氨基酸序列后检测乳制品中提取出的明胶[39-40]。此方法在识别乳制品中使用的明胶来源有着巨大潜力。

2.4 酶联免疫吸附测定法

酶联免疫吸附测定法（ELISA）作为一种特殊的试剂分析检测方法，是基于免疫酶技术的一种新型免疫测定技术手段。此方法主要采用抗原与抗体的特异性反应将被测物与酶结合[41]，通过酶与底物产生特殊的颜色反应，用于定量检测。ELISA常用检测方法主要包括竞争法、双抗体夹心法、抑制性测定法、间接法[42]。其中间接法是目前最常用的方法，如图2所示，加入底物显色，底物降解的量即为被测样本抗体的量。

图2 间接酶联免疫吸附法示意图

Venien等学者为了在低敏感性条件下获得更多特定抗体，增加了抗体对胶原蛋白特定序列的抵抗，通过使用多克隆抗体，显示氨基酸的序列变化[43-44]。于是他们从牛明胶链的末端肽序列选择了一种作为肽1，从牛明胶链的中间部位选择一种公认的物种特异性序列作为肽2。抗肽1抗体的反应活性在与抗肽2抗体相比较时表现为较低的活性状态。经研究发现，抗肽2抗体与牛明胶的反应比猪明胶的反应更剧烈。为了进一步分析研究，当通过间接竞争法ELISA分析研究同样的明胶混合物时，经检测发现，鉴别猪明胶中的牛明胶获得了高的灵敏度。而鉴别高凝冻强度猪明胶中的高凝冻强度牛明胶更为敏感[45-46]。因此，这种ELISA检测技术可以用来区分牛和猪的明胶。尽管此种检测方法在检验灵敏度等方面存在其特有的优越性，在检测熟肉过程中存在的假阳性结限制了其在食品检测中的应用，未来要在其抗干扰性方面加强研究。

3 讨论

明胶作为一种稳定剂在乳制品制作和存储过程中起到不可或缺的作用。食用明胶市场的缺口又造成乳制品生产过程中明胶添加的非法使用，乳制品中明胶的快速、准确检测成为市场的必然要求。传统的光谱技术与液相色谱技术一定程度上能够检测乳制品中的明胶源，在采用合理方法分离出明胶多肽后，通过检测明胶多肽特有的羟脯氨酸实现明胶的快速检测，这种方法具有快速准确的优点。两步沉淀分离法能够实现乳制品明胶的快捷检测，选择合适的沉淀试剂能够保证明胶的高灵敏性检测，但容易受到外界因素干扰。酶联免疫吸附测定法等新型检测方法以其高灵敏度、可靠性等特点成为明胶检测方向，此方法利用抗原与抗体结合的特异性，可实现明胶的定性与定量检测。未来的研究需要提高检测的标准化，促进检测产品的集成化，将基因检测技术、生物技术、材料技术等相互融合，以实现明胶检测全面化发展。同时，新工艺和新技术的迅速发展也会促进新明胶检测技术的不断涌现，实现检测方式的多样化。另外，在明胶的提取、纯化以及抗外界因素干扰等方面也需要加强研究，为明胶检测提供有利保障。